Ayrılması<em> Plasmodium falciparum</emManyetik Yoluyla> Geç Evre-enfekte Eritrositler
Summary
Hemozoin bir paramanyetik özelliklerinin geç aşamalarında izole etmek için kullanılırlar<em> Plasmodium falciparum</emKültüründe büyüyen>-enfekte kırmızı kan hücreleri. Bu yöntem çok kolay ve hızlı ve parazitlerin sonraki invazif yetenekleri etkilemez.
Abstract
Diğer Plasmodium türlerin aksine, P. falciparum onun çalışma 1 kolaylaştırır laboratuar, kültüre edilebilir. Elde parazitemi ≈% 40 sınırına ulaşabilir olsa da, araştırmacı genellikle yaklaşık% 10 oranda tutar. Pek çok durumda, kültür zenginleştirmek ve belirli bir deney ile devam etmek için enfekte olmamış olanlardan parazit içeren kırmızı kan hücrelerinin (eritrositler), izole etmek için gereklidir.
Zaman P. falciparum eritrosit bozar, parazit düşürür ve hemoglobin 2, 3 beslenir. Ancak, parazitin bir çok toksik demir içeren haem parçası 4, 5 ile ilgilenmek zorundadır. Parazit haemozoin 6, 7 olarak adlandırılan bir inert kristal polimer içine haem dönüştürerek kendi toksisite eludes. Bu demir içeren moleküller, gıda vakuol içinde depolanır ve bir metal haem 8 biri farklı bir oksidasyon durumuna sahiptir. Haem demir ferrik durumuozoin bu bulaşmamış eritrosit eksik olan paramanyetik özellikte bahşeder. Işgalci parazit olgunluğa ulaşır gibi haemozoin içeriği de P. son aşamalarında daha paramanyetizma ihsan, 9 da artar eritrosit içindeki falciparum.
Bu paramanyetik özelliği, P. son aşamalarında dayanarak falciparum enfekte-kırmızı kan hücreleri manyetik boncuklar ihtiva eden bir sütun içinden geçen kültür tarafından ayrılabilir. Bunları içeren sütunlar bir mıknatıs tutucu üzerine konulduğunda Bu boncuklar manyetik hale gelir. Flow-through içerecektir iken onların paramanyetizma nedeniyle Enfekte RBCs, sonra çoğunlukla, enfekte olmamış eritrosit ve parazit içerenler erken aşamalarında için, sütun içine hapsolmuş edilecektir.
Burada, biz iyi parazit canlılığı 10 korur manyetik sütunlar ile geç evre parazitlerin nüfusu zenginleştirmek için metodoloji açıklanmaktadır.Bu yordamı gerçekleştirdikten sonra, bekâr kültürü kalan parazitler büyümeye devam sağlamak için bir inkübatör iade edilebilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Sıtma paraziti P. in vitro kültürlerde falciparum kültürü daha fazla olan en yüksek çoğalma noktada enfekte olmamış kırmızı kan hücrelerinin yarısından, sınırlı parazitemi sergiler. En çok araştırma deneyleri için, enfekte olmuş eritrositler ile birlikte çalışmak için sadece arzu edilir. Bu amaçla, bir ayırma tekniği, enfeksiyon göre kültür bölmek için gereklidir. Yararlı yöntemler enfekte olmamış eritrositler 11 ve iki grupların farklı yoğunluk ya…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma tarafından finanse edildi hibe SORUN-009 CS ve Secretaria Nacional de Ciencia y Tecnología (SENACYT), Panama LC doktora bursu için.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| RPMI 1640 Hepes Modified | Sigma-Aldrich | R4130 | Supplemented with 10% human serum, 2% glucose, and 0.2% sodium bicarbonate |
| MidiMACS Separator | MACS Miltenyi BioTec | 130-042-302 | |
| MACS MultiStand | MACS Miltenyi BioTec | 130-042-303 | |
| LS Columns | MACS Miltenyi BioTec | 130-042-401 | |
| Hemacytometer | Grafco | Grafco Neubauer Chamber | Can be found through many other suppliers |
References
- Jensen, J. B., Trager, W. Plasmodium falciparum in culture: use of outdated erythrocytes and description of the candle jar method. J. Parasitology. 63 (5), 883-886 (1977).
- Guzman, I. Y., Francis, S. E., Oksman, A., Smith, C. E., Duffin, K. L., Goldberg, D. E. Order and specificity of the Plasmodium falciparum hemoglobin degradation pathway. J. Clin. Invest. 93, 1602-1608 (1994).
- Rosenthal, P. J., Meshnick, S. R. Hemoglobin catabolism and iron utilization by malaria parasites. Mol. Biochem. Parasitol. 83 (2), 131-139 (1996).
- Fitch, C. D., Chevli, R., Kanjananggulpan, P., Dutta, P., Chevli, K., Chou, A. C. Intracellular ferriprotoporphyrin IX is a lytic agent. Blood. 62 (6), 1165-1168 (1983).
- Hebbel, R. P., Eaton, J. W. Pathobiology of heme interaction with the erythrocyte membrane. Semin. Hematol. 26 (2), 136-149 (1989).
- Egan, T. J. Haemozoin formation. Mol. Biochem. Parasitol. 157 (2), 127-136 (2008).
- Hempelmann, E., Marques, H. M. Analysis of malaria pigment from Plasmodium falciparum. J. Pharmacol. Toxicol. Methods. 32 (1), 25-30 (1994).
- Fitch, C. D., Kanjananggulpan, P. The state of ferriprotoporphyrin IX in malaria pigment. J. Biol. Chem. 262 (32), 15552-15555 (1987).
- Moore, L. R., Fujioka, H., Williams, P. S., Chalmers, J. J., Grimberg, B., Zimmerman, P. A., Zborowski, M. Hemoglobin degradation in malaria-infected erythrocytes determined from live cell magnetophoresis. FASEB J. 20 (6), 747-749 (2006).
- Spadafora, C., Gerena, L., Kopydlowski, K. M. Comparison of the in vitro invasive capabilities of Plasmodium falciparum schizonts isolated by Percoll gradient or using magnetic based separation. Malaria J. 10, 96 (2011).
- Jackson, K. E., Spielmann, T., Hanssen, E., Adisa, A., Separovic, F., Dixon, M. W., Trenholme, K. R., Hawthorne, P. L., Gardiner, D. L., Gilberger, T., Tilley, L. Selective permeabilization of the host cell membrane of Plasmodium falciparum-infected red blood cells with streptolysin O and equinatoxin II. Biochem. J. 403, 167-175 (2007).
- Goodyer, I. D., Johnson, J., Eisenthal, R., Hayes, D. J. Purification of mature-stage Plasmodium falciparum by gelatine flotation. Ann. Trop. Med. Parasitol. 88 (2), 209-211 (1994).
- Pasvol, G., Wilson, R. J., Smalley, M. E., Brown, J. Separation of viable schizont-infected red cells of Plasmodium falciparum from human blood. Ann. Trop. Med. Parasitol. 72, 87-88 (1978).
- Pertoft, H. Fractionation of cells and subcellular particles with Percoll. J. Biochem. Biophys. Methods. 44 (1-2), 1-30 (2000).
- Paul, F., Roath, S., Melville, D., Warhurst, D. C., Osisanya, J. O. S. Separation of malaria-infected erythrocytes from whole blood: use of a selective high-gradient magnetic separation technique. The Lancet. 318, 70-71 (1981).
- Trang, D. T., Huy, N. T., Kariu, T., Tajima, K., Kamei, K. One-step concentration of malarial parasite-infected red blood cells and removal of contaminating white blood cells. Malar. J. 3, 7 (2004).
- Nillni, E. A., Londner, M. V., Spira, D. T. A simple method for separation of uninfected erythrocytes from those infected with Plasmodium berghei and for isolation of artificially released parasites. Z. Parasitenkd. 64, 279-284 (1981).
