En<em> In vitro</em> Modell for å studere heterogenitet of Human Macrophage Differensiering og Polarisering
Summary
, Blodmonocyttavledede makrofager er viktige celler i det medfødte immunsystemet. Her beskriver vi en lett å bruke<em> In vitro</em> Modell for å generere disse cellene. Ved hjelp av gradientsentrifugering, negativ vulsten isolasjon og spesifikke cellekultur-forhold, kan, blodmonocyttavledede makrofager bli generert for fenotypiske og funksjonelle studier.
Abstract
, Blodmonocyttavledede makrofager er en viktig celletype av det medfødte immunsystemet. Musemodeller studerer makrofag biologi lider av de fenotypiske og funksjonelle forskjeller mellom murine og humane, blodmonocyttavledede makrofager. Derfor har vi her beskriver en in vitro-modell for å generere og studere primære humane makrofager. Kort, etter tetthetsgradient-sentrifugering av perifert blod trekkes fra en underarm vene, er monocytter isolert fra perifere mononukleære celler ved hjelp av negativ magnetiske kuler isolasjon. Disse monocyttene blir deretter dyrket i seks dager under bestemte forhold for å fremkalle forskjellige typer av makrofag differensiering eller polarisering. Modellen er enkel å bruke og omgår problemene forårsaket av artsspesifikke forskjeller mellom mus og menneske. Videre er det nærmere den in vivo-betingelser enn bruk av immortaliserte cellelinjer. I konklusjonen, er modellen beskrevet her egnet til å studere macrophage biologi, identifisere sykdomsmekanismer og nye terapeutiske mål. Selv om ikke fullt ut erstatte eksperimenter med dyr eller menneskelige vev innhentet post mortem, gjør at modellen er beskrevet her identifisering og validering av sykdomsmekanismer og terapeutiske mål som kan være svært relevant for ulike menneskelige sykdommer.
Introduction
, Blodmonocyttavledede makrofager representerer en viktig cellulær komponent i det medfødte immunsystemet, og bidra til mange akutte og kroniske inflammatoriske prosesser en. Makrofager spiller en viktig rolle i mange inflammatoriske sykdommer som aterosklerose eller kreft 2.. Makrofager viser en høy grad av plastisitet, og er i stand til å anta forskjellig fenotype avhengig av den lokale micromilieu 3.. Således studere makrofag differensiering og heterogenitet er viktig for å øke vår kunnskap om patofysiologien for en rekke sykdommer og for å tillate identifisering av nye terapeutiske mål og utviklingen av nye terapier.
I mange tilfeller er murine modellene benyttet for å undersøke patofysiologien av spesifikke sykdommer. Men studerer makrofag biologi ved hjelp av mus modeller ledsaget av flere svakheter: (1) Andelen av leukocytter undergruppe tall (dvs. monocytter og granulocytter) i peripHéral blod av mus eller mennesker skiller seg vesentlig foreslå ulike roller monocytter i murine og menneskelige patofysiologi. (2) Det er betydelige forskjeller i genuttrykk mellom murine og humane perifere blod monocytter tyder på betydelige forskjeller i sin funksjon under helse og sykdom fire. (3) En rekke markører som brukes til å identifisere murine monocytter og makrofager (F4/80, LYC, etc.) Ikke finnes i humane myeloidceller, foretar overføringen av funnene i musemodeller til den menneskelige situasjon ganske vanskelig.
Derfor, for å øke vår forståelse av makrofager differensiering og heterogenitet i menneskelig sykdom, må vi gjøre bruk av modeller som arbeider med menneskelige makrofager. Derfor har vi her beskriver en modell av human makrofag primære generasjon som er lett å bruke og tillater undersøkelse av humane monocytt-avledede makrofager in vitro, under forskjellige forhold, som resulterer i forskjellige makrofag polarisering typer. I flere studier, har vi brukt in vitro modell av blodmonocyttavledede primære humane makrofager å analysere makrofag biologi og dens potensielle relevans for mennesker aterosklerose 5-7.
Selv om ikke fullt ut erstatte eksperimenter med dyr eller menneskelige vev innhentet post mortem, gjør at modellen er beskrevet her identifisering og validering av sykdomsmekanismer og terapeutiske mål som kan være svært relevant for ulike menneskelige sykdommer.
Protocol
Representative Results
Discussion
, Blodmonocyttavledede makrofager representerer nøkkelen celletype av det medfødte immunsystemet. De spiller en viktig rolle i mange inflammatoriske sykdommer omfattende aterosklerose eller kreft 2.. Således studere makrofag biologi er viktig for å øke vår kunnskap på patofysiologien for en rekke sykdommer og for å tillate utvikling av nye behandlingsformer.
Mange studier gjelder mus modeller overekspresjon eller mangler visse gener av interesse. I tilfelle av, blodmonocyt…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Nadine Wambsganss for utmerket teknisk assistanse. Dette arbeidet ble støttet av et stipend fra Deutsche Forschungsgemeinschaft (GL599/1-1) og delvis av en bevilgning fra Innovation Fund FRONTIER (University of Heidelberg) til CAG
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| 50 ml centrifuge tube (sterile) | Fisher | 055398 | |
| D-PBS (1X), liquid (no calcium or magnesium) | Invitrogen | 14190-250 | |
| EDTA | Sigma | T9285 | |
| BSA | Sigma | A-8806 | |
| FCS | Invitrogen | ||
| EasySep Human Monocyte Enrichment Kit | StemCell Technologies | 19059 | |
| EasySep Magnet | StemCell Technologies | 18000 | |
| FACS tubes | Fisher | 352008 | |
| Macrophage-SFM (1X) | Invitrogen | 12065-074 | |
| Penicillin-streptomycin | Sigma | P-4458 | |
| Nutridoma-SP | Roche | 11011375001 | |
| human M-CSF 10 μg | Peprotech | 300-25 | |
| Cell Culture Plates 6-well | Fisher | 07-200-80 |
References
- Gordon, S., Taylor, P. R. Monocyte and macrophage heterogeneity. Nat. Rev. Immunol. 5, 953-964 (2005).
- Gordon, S., Mantovani, A. Diversity and plasticity of mononuclear phagocytes. European Journal of Immunology. 41, 2470-2472 (2011).
- Martinez, F. O., Sica, A., Mantovani, A., Locati, M. Macrophage activation and polarization. Front. Biosci. 13, 453-461 (2008).
- Ingersoll, M. A., et al. Comparison of gene expression profiles between human and mouse monocyte subsets. Blood. 115, 10-19 (2010).
- Gleissner, C. A., Sanders, J. M., Nadler, J., Ley, K. Upregulation of aldose reductase during foam cell formation as possible link among diabetes, hyperlipidemia, and atherosclerosis. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 28, 1137-1143 (2008).
- Gleissner, C. A., et al. CXCL4 downregulates the atheroprotective hemoglobin receptor CD163 in human macrophages. Circ. Res. , (2009).
- Gleissner, C. A., Shaked, I., Little, K. M., Ley, K. CXC chemokine ligand 4 induces a unique transcriptome in monocyte-derived macrophages. J. Immunol. 184, 4810-4818 (2010).
- Martinez, F. O., Gordon, S., Locati, M., Mantovani, A. Transcriptional profiling of the human monocyte-to-macrophage differentiation and polarization: New molecules and patterns of gene expression. J. Immunol. 177, 7303-7311 (2006).
- Verreck, F. A. W., et al. Human il-23-producing type 1 macrophages promote but il-10-producing type 2 macrophages subvert immunity to (myco)bacteria. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 4560-4565 (2004).
- Rey-Giraud, F., Hafner, M., Ries, C. H. In vitro generation of monocyte-derived macrophages under serum-free conditions improves their tumor promoting functions. PLoS One. 7, e42656 (2012).
- Boyle, J. J., et al. Coronary intraplaque hemorrhage evokes a novel atheroprotective macrophage phenotype. American Journal of Pathology. 174, 1097-1108 (2009).
- Cho, H. J., et al. Induction of dendritic cell-like phenotype in macrophages during foam cell formation. Physiol Genomics. 29, 149-160 (2007).
- Vogt, G., Nathan, C. In vitro differentiation of human macrophages with enhanced antimycobacterial activity. The Journal of Clinical Investigation. 121, 3889-3901 (2011).
- Mikita, T., Porter, G., Lawn, R. M., Shiffman, D. Oxidized low density lipoprotein exposure alters the transcriptional response of macrophages to inflammatory stimulus. Journal of Biological Chemistry. 276, 45729-45739 (2001).
- Qin, Z. Y. The use of THP-1 cells as a model for mimicking the function and regulation of monocytes and macrophages in the vasculature. Atherosclerosis. 221, 2-11 (2012).
- Daigneault, M., Preston, J. A., Marriott, H. M., Whyte, M. K. B., Dockrell, D. H. The identification of markers of macrophage differentiation in pma-stimulated THP-1 cells and monocyte-derived macrophages. PLoS One. 5, e8668 (2010).
- Wahl, L. M., Wahl, S. M., Smythies, L. E., Smith, P. D. Isolation of human monocyte populations. Current Protocols in Immunology. , (2001).
- Waldo, S. W., et al. Heterogeneity of human macrophages in culture and in atherosclerotic plaques. Am. J. Pathol. 172, 1112-1126 (2008).
- Martín-Fuentes, P., et al. Individual variation of scavenger receptor expression in human macrophages with oxidized low-density lipoprotein is associated with a differential inflammatory response. The Journal of Immunology. 179, 3242-3248 (2007).
