Summary

<em> במבחנה</em> מודל ללמוד ההטרוגניות של בידול Macrophage אדם וקיטוב

Published: June 12, 2013
doi:

Summary

מקרופאגים הנגזרות מונוציטים הם תאים חשובים של מערכת החיסון המולדת. כאן, אנו מתארים קלים לשימוש<em> במבחנה</em> מודל ליצירת תאים אלה. השימוש בצנטריפוגה שיפוע, בידוד חרוז שלילי ותנאי תרבות תאים מסוימים, יכולים להיות שנוצרו מקרופאגים מונוציטים הנגזרות ללימודים פנוטיפי ופונקציונליים.

Abstract

מקרופאגים מונוציטים הנגזרות מייצגים סוג תא חשוב של מערכת החיסון המולדת. מודלים עכבר הלומדים ביולוגיה מקרופאג סובלים מההבדלים פנוטיפי ופונקציונליים בין מקרופאגים מונוציטים הנגזרות Murine והאנושיים. לכן, לנו כאן לתאר במודל חוץ גופית כדי ליצור וללמוד מקרופאגים האנושיים העיקריים. בקצרה, לאחר צנטריפוגה שיפוע הצפיפות של דם היקפי נמשך מוריד בזרוע, מונוציטים מבודדים מתאי דם היקפיים mononuclear באמצעות בידוד חרוז מגנטי שלילי. מונוציטים אלה בתרבית, במשך שישה ימים בתנאים מסוימים לגרום לסוגים שונים של בידול מקרופאג או קיטוב. המודל הוא קל לשימוש ועוקף את הבעיות שנגרמו על ידי הבדלים בין מינים ספציפי עכבר ואדם. יתר על כן, הוא קרוב יותר לתנאים בvivo מאשר השימוש בשורות תאים הונצחו. לסיכום, המודל שתואר כאן הוא מתאים ללמוד macrophagביולוגיה דואר, לזהות מנגנוני מחלה ומטרות טיפוליות חדשניות. למרות שאינך מחליף באופן מלא ניסויים עם בעלי חיים או רקמות אדם שנלקחו לאחר מוות, המודל שתואר כאן מאפשר זיהוי ואימות של מנגנוני מחלה ומטרות טיפוליות שעשויות להיות רלוונטיות מאוד למחלות אנושיות שונות.

Introduction

מקרופאגים מונוציטים הנגזרות מייצגים מרכיב תאי חשוב של מערכת החיסון המולדת ולתרום לתהליכים דלקתיים רבים 1 אקוטיים או כרוניים. המקרופאגים משחקים תפקיד חשוב במחלות דלקתיות כמו טרשת עורקים רבות או סרטן 2. המקרופאגים מראים רמה גבוהה של גמישות והם מסוגלים להניח פנוטיפים שונים בהתאם לmicromilieu המקומי 3. לפיכך, לומד בידול מקרופאג וההטרוגניות הוא חיוני להגדלת הידע של הפתופיזיולוגיה של מחלות רבות שלנו ועל מנת לאפשר זיהוי מטרות טיפוליות חדשניות ופיתוח של טיפולים חדשניים.

במקרים רבים, מודלים Murine משמשים כדי לחקור את הפתופיזיולוגיה של מחלות ספציפיות. עם זאת, לומד ביולוגיה מקרופאג באמצעות מודלים עכבר מלווה בכמה חסרונות: (1) חלקם של מספרי קבוצת משנה ויקוציטים (מונוציטים וגרנולוציטים כלומר) בperipדם heral של עכברים או בני אדם שונה באופן משמעותי המצביע על תפקידים שונים של מונוציטים בפתופיזיולוגיה עכברית ואנושית. (2) יש הבדלים משמעותיים בביטוי גנים בין מונוציטים בדם היקפיים Murine והאנושיים המצביעים על הבדלים משמעותיים בתפקודם במהלך מחלה ובריאות 4. (3) מספר הסמנים המשמשים לזיהוי מונוציטים ומקרופגים (F4/80, LYC, וכו '.) עכבריים אינה קיימים בתאי מיאלואידית אדם, מה שהופך את העברת ממצאים במודלים של עכבר למצב האנושי קשה למדי.

לכן, על מנת להגביר את ההבנה של בידול מקרופאג וההטרוגניות במחלה אנושית שלנו, אנחנו צריכים לעשות שימוש במודלים שעובדים עם מקרופאגים אדם. לכן, לנו כאן לתאר מודל של דור מקרופאג העיקרי אדם כי הוא קל לשימוש ומאפשר לימוד של מקרופאגים מונוציטים הנגזרות אדם במבחנה בתנאים שונים וכתוצאה מכך שונה מקרופאג פוסוגי larization. במספר מחקרים, יש לנו להשתמש במודל חוץ גופית של מקרופאגים האנושיים העיקריים מונוציטים הנגזרות לנתח ביולוגיה מקרופאג ואת הרלוונטיות שלה לטרשת עורקת פוטנציאל אנושית 5-7.

למרות שאינך מחליף באופן מלא ניסויים עם בעלי חיים או רקמות אדם שנלקחו לאחר מוות, המודל שתואר כאן מאפשר זיהוי ואימות של מנגנוני מחלה ומטרות טיפוליות שעשויות להיות רלוונטיות מאוד למחלות אנושיות שונות.

Protocol

1. פרוטוקול הכן חוצצים כדלקמן: הכן את החיץ לבידוד PBMC: "לשטוף חיץ" = 0.02% EDTA ב PBS (שימוש 0.5 M EDTA). הכן את החיץ לבידוד מונוציטים: "חיץ שטיפת מקינ…

Representative Results

באמצעות הפרוטוקול שתואר לעיל, באופן שגרתי אנחנו להשיג 25.1 דם x 10 6 ± 2.2 x 10 6 monocytes/100 מ"ל (שגיאה ממוצעת ± סטנדרטי מ -26 ניסויים בלתי תלויים, איור 1 א). טוהר מונוציטים כפי שנקבע על ידי צביעת תזרים cytometric לCD14 הוא באופן שגרתי יותר מ -95% (97.1 ± 0.4%, סטיית תקן ממוצע…

Discussion

מקרופאגים מונוציטים הנגזרות מייצגים את סוג התא המרכזי של מערכת החיסון המולדת. הם משחקים תפקיד חשוב במחלות דלקתיות רבות, כולל טרשת עורקים או סרטן 2. לפיכך, לומד ביולוגיה מקרופאג הוא חיוני להעמקת הידע שלנו על הפתופיזיולוגיה של מחלות רבות ולאפשר פיתוח של טיפולים ח…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

אנו מודים Wambsganss נאדין לקבלת סיוע טכני מעולה. עבודה זו נתמכה על ידי מענק מטעם Forschungsgemeinschaft דויטשה (GL599/1-1) ובחלקו על ידי מענק מקרן חדשנות הגבול (אוניברסיטת היידלברג) לחטיבה

Materials

Name of Reagent/Material Company Catalog Number Comments
50 ml centrifuge tube (sterile) Fisher 055398  
D-PBS (1X), liquid (no calcium or magnesium) Invitrogen 14190-250  
EDTA Sigma T9285  
BSA Sigma A-8806  
FCS Invitrogen    
EasySep Human Monocyte Enrichment Kit StemCell Technologies 19059  
EasySep Magnet StemCell Technologies 18000  
FACS tubes Fisher 352008  
Macrophage-SFM (1X) Invitrogen 12065-074  
Penicillin-streptomycin Sigma P-4458  
Nutridoma-SP Roche 11011375001  
human M-CSF 10 μg Peprotech 300-25  
Cell Culture Plates 6-well Fisher 07-200-80  

References

  1. Gordon, S., Taylor, P. R. Monocyte and macrophage heterogeneity. Nat. Rev. Immunol. 5, 953-964 (2005).
  2. Gordon, S., Mantovani, A. Diversity and plasticity of mononuclear phagocytes. European Journal of Immunology. 41, 2470-2472 (2011).
  3. Martinez, F. O., Sica, A., Mantovani, A., Locati, M. Macrophage activation and polarization. Front. Biosci. 13, 453-461 (2008).
  4. Ingersoll, M. A., et al. Comparison of gene expression profiles between human and mouse monocyte subsets. Blood. 115, 10-19 (2010).
  5. Gleissner, C. A., Sanders, J. M., Nadler, J., Ley, K. Upregulation of aldose reductase during foam cell formation as possible link among diabetes, hyperlipidemia, and atherosclerosis. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 28, 1137-1143 (2008).
  6. Gleissner, C. A., et al. CXCL4 downregulates the atheroprotective hemoglobin receptor CD163 in human macrophages. Circ. Res. , (2009).
  7. Gleissner, C. A., Shaked, I., Little, K. M., Ley, K. CXC chemokine ligand 4 induces a unique transcriptome in monocyte-derived macrophages. J. Immunol. 184, 4810-4818 (2010).
  8. Martinez, F. O., Gordon, S., Locati, M., Mantovani, A. Transcriptional profiling of the human monocyte-to-macrophage differentiation and polarization: New molecules and patterns of gene expression. J. Immunol. 177, 7303-7311 (2006).
  9. Verreck, F. A. W., et al. Human il-23-producing type 1 macrophages promote but il-10-producing type 2 macrophages subvert immunity to (myco)bacteria. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 4560-4565 (2004).
  10. Rey-Giraud, F., Hafner, M., Ries, C. H. In vitro generation of monocyte-derived macrophages under serum-free conditions improves their tumor promoting functions. PLoS One. 7, e42656 (2012).
  11. Boyle, J. J., et al. Coronary intraplaque hemorrhage evokes a novel atheroprotective macrophage phenotype. American Journal of Pathology. 174, 1097-1108 (2009).
  12. Cho, H. J., et al. Induction of dendritic cell-like phenotype in macrophages during foam cell formation. Physiol Genomics. 29, 149-160 (2007).
  13. Vogt, G., Nathan, C. In vitro differentiation of human macrophages with enhanced antimycobacterial activity. The Journal of Clinical Investigation. 121, 3889-3901 (2011).
  14. Mikita, T., Porter, G., Lawn, R. M., Shiffman, D. Oxidized low density lipoprotein exposure alters the transcriptional response of macrophages to inflammatory stimulus. Journal of Biological Chemistry. 276, 45729-45739 (2001).
  15. Qin, Z. Y. The use of THP-1 cells as a model for mimicking the function and regulation of monocytes and macrophages in the vasculature. Atherosclerosis. 221, 2-11 (2012).
  16. Daigneault, M., Preston, J. A., Marriott, H. M., Whyte, M. K. B., Dockrell, D. H. The identification of markers of macrophage differentiation in pma-stimulated THP-1 cells and monocyte-derived macrophages. PLoS One. 5, e8668 (2010).
  17. Wahl, L. M., Wahl, S. M., Smythies, L. E., Smith, P. D. Isolation of human monocyte populations. Current Protocols in Immunology. , (2001).
  18. Waldo, S. W., et al. Heterogeneity of human macrophages in culture and in atherosclerotic plaques. Am. J. Pathol. 172, 1112-1126 (2008).
  19. Martín-Fuentes, P., et al. Individual variation of scavenger receptor expression in human macrophages with oxidized low-density lipoprotein is associated with a differential inflammatory response. The Journal of Immunology. 179, 3242-3248 (2007).

Play Video

Cite This Article
Erbel, C., Rupp, G., Helmes, C. M., Tyka, M., Linden, F., Doesch, A. O., Katus, H. A., Gleissner, C. A. An In vitro Model to Study Heterogeneity of Human Macrophage Differentiation and Polarization. J. Vis. Exp. (76), e50332, doi:10.3791/50332 (2013).

View Video