外傷性脳損傷後の神経細胞や遺伝子発現解析のための単一ニューロンの濃縮された集団のレーザーキャプチャーマイクロダイセクション

1。外科的処置とTBI流体パーカッション全ての動物実験は、まず動物実験（第8版、全米研究評議会）のお手入れと使用のためのテキサスメディカルブランチ、ガルベストン、テキサス州と健康ガイドの国立研究所の大学の施設内動物のケアと使用委員会によって承認されています。 ラット（ベンダーチャールズ川から得られた成体雄Sprague-Dawleyラットに、400〜500グラム、ポートランド、メイン州）がケージあたり2を収容し、これらの一定の条件をビバリウム内に食品や水を自由に提供されています：1800への光サイクル（600時間使用する時間）、温度（21℃〜23℃）、湿度（40％〜50％）の1週間前。 4％、イソフルラン挿管、機械的換気でラットを麻酔（NEMI科学、ニューイングランドの医療機器、メドウェイ、マサチューセッツ州）は、酸素でイソフルラン1.5から2.0パーセントを有するラット：空気（70:30）と流体パーカッション矢のためにそれらを準備前述のように負傷。8、10 実験デザインに応じて損傷後の適切な時点でラットを生け贄に捧げる。迅速に、脳を除去し、直ちにドライアイスで凍結し、-80℃で保存50mlチューブ内のCまたは凍結切片のため10月に埋め込む直ちに進みます。 2。セクショニングとラット脳の染色一定の温度に保たれた場合は、直ちに使用されていない脳組織は、1月までのために-80℃に保つことができる。 -80℃で凍結されている脳は、その後°その後切片は、-20°Cに解凍し、C、および再凍結融解後の第二品質のRNAが得られない。脳は、解凍された10月に搭載され、区分されたされた後、スライドは24時間以内に染色し、染色の1時間〜30分以内にLCMを使用する必要があります。これは、良い品質のRNAを確実にするでしょう。 LCM後、LCMのキャップに捕捉された細胞は、最大一週間、-80℃での溶解バッファーに格納することができますが、RNAは、最高の品質を確保するために、適時に隔離されるべきである。<は/ LI> 前に脳を区画には、RNase-ZAPとクライオスタットを拭くとEtOH（それぞれの脳の間に使い捨ての刃を交換して）でブラシを清掃してください。 -80℃の冷凍庫から50 mlチューブで脳を取り出し、-22℃で約10分間、チューブ内の雪解けの温度でクライオスタット内に配置します。ガーゼでステージ上にチューブと場所、アップ腹側から脳を取り出します。 カミソリの刃を用いて、小脳と視交叉における前方部分にちょうど吻側脳の後方部分を削除するために脳をスライス。 10月取付媒体（ティッシュテック）とcryomoldをご記入のうえ、前方側に金型に脳を下に置きます。それが白に変わったら（約10分）まで、脳組織がマウント培地で凍結することができます。 10月と脳に試料ディスク（ティッシュテック）を凍結します。金型から脳を取り出します。試料ヘッドに脳を挿入して、ネジを締めます。 disposaを挿入BLE、ロープロファイルナイフホルダーにブレード（フィッシャーサイエンティフィック）とレバーを締めます。 10月の外側の層を除去するために、20μm以下で脳をスライスし始める。海馬領域に達すると、10ミクロンにダイヤルを設定してください。組織切片（フィッシャー·サイエンティフィック）の上にガラススライドまたはプラススラ​​イドガラスを配置することにより、冠状連続切片を収集します。セクショニングが完了するまで、スライドはRNaseフリーの染色ラックに-20℃で保存されている。 組織切片が処理されるガラス製品からすべてのRNaseを除去するには、すべての染色コンテナを拭うとエリミナーゼ（フィッシャーサイエンティフィック）とシリンダーを卒業し、ミリQ水ですすいでください。 RNaseフリー水ですべてのソリューションを用意し、クレシルバイオレット（Sigma-Aldrich社）とフルオロジェイド（ヒスト-CHEM）を使用する前に0.2μmのフィルターで染色をフィルタリングします。 30秒RTで脳切片を解凍し、75％エタノール（1分）で固定します。 定着後のシングル負傷したニューロンのLCMは、RNaseフリーの水（1分）で、スライドをすすぎ、1％クレシルバイオレット（15-20秒）で対比染色、RNaseフリー水（2×30秒）ですすぎ、フルオロジェイド（4分）で染色し、RNaseフリー水（3×1分）ですすぎRNaseフリー水（30秒）、100％EtOHを（30秒）、キシレン（2×3分）から作られた95％エタノールで脱水する。 定着後のニューロンのスワスのLCMは、RNaseフリー水（1分）で、スライドをすすぎ、1％クレシルバイオレット（1分）で染色し、（3×1分）のためにRNaseフリー水ですすぎ、95％の脱水をEtOH（2×30秒）、100％EtOHを（2×30秒）、キシレン（2×3分）。 空気は、LCMに先立って15分間換気フード内のすべてのセクションを乾燥させてください。彼らは部屋から部屋へと転送することが必要な場合は、スライドセクション側は、乾燥剤が並んでスライドボックスには、最大保存することができます。のセクションでは、乾燥している後に、LCMがすぐに実行された場合は、最適な結果が得られる。 LCMは、30分〜1時間に制限すべきである。次のセクションでは、EAである細胞の連続帯状の領域をキャプチャする方法について説明します第一このテクニックを学んでいる人のためにマスターするsiest。その後、我々は正確に単一ニューロンをキャプチャする方法について説明します。私たちの手順では、変性ニューロンのフルオロジェイド·マーカーに対するその親和性によって瀕死のニューロンを特定します。フルオロジェイド陰性細胞は、ニューロンを存続されるものとみなされます。 3。レーザーキャプチャーマイクロダイセクション（LCM） 海馬神経細胞の濃縮された集団のスワスのLCM LCMは、赤外ダイオードレーザー（Life Technologies社）でPixCell IIE顕微鏡を使用して実行されます。 垂直位置に中央のジョイスティックを調整します。回転させ、所定の位置に4X目標をロックします。 海馬の領域が表示されているまで、顕微鏡ステージの中心にスライドを入れて、手動で調整してください。焦点にイメージを持って来るために粗調整と微フォーカス調整を使用しています。 コントローラ上の真空ボタンを押すことによって、真空チャックをアクティブにします。 PLに10X対物レンズを回転させ、ロックエース。粗調整と微調整を再び焦点を当てる。 負荷線の位置にキャップがポイカセットモジュールと位置にポイカプセルマクロLCMキャップ（Life Technologies）をロードします。キャップの周りにキャップの配置アームと位置を回転させます。カセットモジュールからポイカプセルのキャップを除去するためにキャップの配置アームを持ち上げます。 スライド上にキャップの配置アームを回転させて、スライド上に腕を下げる、これはスライド上にキャップを置きます。ファインフォーカスを調整し、細胞がキャップに黒の円の内側にあるかどうかを確認するジョイスティックを動かします。すべてのセルのキャプチャはこの黒丸内にある必要があります。 レーザパラメータを設定します。まず、コントローラ上のレーザー有効ボタンを押してください。レーザーターゲットスポットはコンピュータのモニター上視野内のピンクのドットのように見えるようになります。 75 mWで、1.0から2.0ミリ秒のための最適な細胞捕獲の必要に応じて – レーザーの焦点を合わせると65〜パワーと持続時間を調整するために小さなレーザスポットサイズ（7.5μm）を設定します。 TEにレーザーST、ピックアップする細胞が存在しない領域にレーザスポットを移動するためにジョイスティックを使用しています。親指スイッチを使用してレーザーを発射。目に見えるダークリングは、レーザーが発射された明確な領域を囲むかどうかを確認するために離れて溶融ポリマースポットからレーザスポットを移動し、チェックするためにジョイスティックを使用しています。 細胞を捕捉するには、キャプチャするために、細胞の領域の上にレーザスポットを移動するためにジョイスティックを使用しています。親指スイッチを使用してレーザーを発射。細胞の大きな領域をキャプチャするためにレーザーを発射しながらジョイスティックを動かします。レーザーが発射されるとき、それは標的細胞の表面にキャップに熱可塑性ポリマーフィルムを溶融する。ポリマーは、このように将来の分子アプリケーションのためのサンプルの整合性を確保したRNA、DNAやタンパク質を変更しない、レーザー放射を吸収する。 興味のあるすべてのセルを焼成した後、キャップの配置アームを持ち上げる。捕捉された細胞は、組織切片から分離してポイカプセルのキャップに付着する。残りの組織および欠損セルが可視になります視野内ible。キャップ上の細胞はまた、スライドの空の部分にキャップを配置することにより閲覧することができます。 キャップの配置アームを持ち上げ、キャップStationをアンロードするためにそれを回転させます。駅にキャップを下げて元の位置に戻してキャップの配置アームを回転させます。 プラットフォームに沿って、キャップの上にポイカプセル挿入工具をスライドさせます。プラットフォームからツールを持ち上げます。キャップが取り付けられたままになります。軽く不要な組織を離れてきれいにポイカプセルクリーンパッドにキャップを触れないでください。 RNAqueousマイクロアイソレーションキットから得られた溶解バッファー100μlで満たさ0.5ミリリットルRNaseフリーのチューブにキャップを置きます。細胞を溶解するために30秒間ボルテックス直ちにキャップ。 42℃でインキュベートする-80℃で30分間、そして凍結用のC°CのRNA分離まで。 海馬における単一FJ +ニューロンのLCM 単一細胞を捕捉するには、ポイカセットモジュールとpositiにポイカプセルHS LCMキャップを読み込む負荷線の位置でキャップに。キャップの配置アームを回転させ、キャップの周りに配置します。カセットモジュールからポイカプセルのキャップを除去するためにキャップの配置アームを持ち上げます。 レーザーの焦点を合わせると、単一細胞の最適な細胞捕獲用の0.45から0.50ミリ秒のために65 -75 mWまでレーザパワーと持続時間を調整するために小さなレーザスポットサイズ（7.5μm）を設定します。 スライド上にキャップの配置アームを回転させて、スライドに向かって腕を下げる。これは、スライド上にキャップを置きます。ポイカプセルのHSキャップ面は、LCM中のサンプルから高架に座っている。 シングルFJ +細胞にレーザを移動するジョイスティックを使用しています。キャプチャされてすべての細胞は、キャップに小さな黒いリングの内側になければなりません。親指スイッチを使用してレーザーを発射。 黒丸区域内のすべての細胞がレーザーを発射されたとき、キャップの配置アームを持ち上げる。捕捉された細胞は、組織切片から分離してポイカプセルHSキャップに付着する。 マイクロ上の別のスライドを入れステージに対応したHSキャップがいっぱいになるまでのFJ +細胞を収集します。溶解バッファーの40〜50μlで埋め0.5ミリリットルRNaseフリーのチューブにキャップを置きます。細胞を溶解するために30秒間ボルテックス直ちにキャップ。 42℃でインキュベートする-80℃で30分間、そして凍結用のC°CのRNA分離まで。 4。 LCMサンプルからトータルRNAの分離（このセクションは、単にビデオのプレゼンテーションで説明されます） 細胞からの全RNAを、製造業者のプロトコールに従ってRNAqueous-Micro社キット（Ambion）を用いて単離される。全ての試薬および洗浄溶液は、このキットで提供されています。フィルタに溶解液バッファー30μlを添加することにより、プリウェットミクロフィルターカートリッジアセンブリ。 5分後、10,000×gで30秒間遠心フィルターを。 サンプル溶解液にLCM添加剤の3μlを加え、ピペットで混合し、遠心分離する。 サンプル溶解液に100％EtOHを（1/2量）52μlを加え、ピペットで混合し、フィルターにライセートを転送するコラム。 カラムにRNAに結合するには、1分間10,000×gでフィルターカラムを遠心します。 1サンプルに対して複数のキャップがある場合は、別々に同じカラムを通して各ライセートをスピン。 RNAqueousマイクロキットに記載されているようRNA分離手順を完了します。 キットに記載されているようLCM RNAサンプルのDNase処理およびDNase不活化を実行し、-80℃でRNaseフリーのチューブや店舗にRNAを転送℃に 5。 RNA定量と下流のアプリケーション RNAの品質と定量化の評価は、製造業者のプロトコルに従ってピコ·キット（Agilent Technologies社、サンタクララ、カリフォルニア州）からの試薬を使用してAgilentバイオアナライザを用いて行われる。 全RNAをAgilentバイオアナライザー2100（アジレント·テクノロジー）で分析されています。ソフトウェアは、各サンプルの範囲のfにRNAの完全数（RIN）を割り当てることによって、濃度およびRNAサンプルの完全性を評価するromは1から10まで。 1-5は、分解されたRNAを示し、7月10日は、良い品質のRNAを示しています。 SYBR-グリーンケミストリーを使用して、個々のTaqmanアッセイまたはRT2プロファイラアレイ、劣化していない無傷のRNAは、リアルタイムPCRに使用されます。 RNAは、mRNAのマイクロアレイ解析とmicroRNAのマイクロアレイ解析に使用することができます。