ニワトリ胚脊髄スライス培養プロトコル

1。必要な溶液を作る 1 Mリン酸緩衝液：109.4グラムのNa 2 HPO 4、32グラムのNaH 2 PO 4を秤量、H 2 0、1リットルの全量を水に混ぜて溶かす。 リン酸緩衝生理食塩水（PBS）：0.1 Mリン酸緩衝液、0.15M NaClを準備します。 PBSを100ミリリットル、10胚からスライスの処理のために十分であるべきです。 アガロース：約70〜ヒートPBS溶液℃、固体低融点アガロースを加え、ゆっくり連続的に攪拌しながら。 4％（w / v）アガロースの最終濃度に溶液を作る。この溶液50mlの在庫を確認します。必要になるまで48℃に保た℃の水浴にこのソリューションを残す。実験後、未使用の任意のアガロース溶液は数週間のために4℃で保存することができます。 抗体·ブロック·ソリューション：最終concentrにウシ胎児血清およびTriton X-100を追加1％のation（v / v）ウシ胎児血清、0.1％（v / v）トリトンX-100、PBSインチブロック溶液10ml凍結切片のスライド5枚の免疫染色のために十分であろう。 固定液：0.75ミリメートルのNaOH、4％（w / v）パラホルムアルデヒド（注意）を準備します。 70への水の熱固定に必要な量を準備するには℃、溶解するまで固体パラホルムアルデヒドとミックスを追加し、必要な最終濃度に濃NaOHを加える。 4℃に氷冷しこの溶液10ml胚スライスの20ウェルのために十分であろう。 ショ糖液：0.1 Mリン酸緩衝液を含む30％（w / v）スクロース溶液10mlを準備します。この溶液10ml胚スライスの10ウェルのために十分であろう。 70％（v / v）エタノールは、水30mlと無水エタノール70mlを希釈します。 培養液：1％ニワトリ胚エキス、1％ペニシリン/ストレプトマイシン、0.35％のL-グルタミン、0.1％2 – mercaptoethの溶液を調製anol、4％ニワトリ血清、2％B27サプリメント、100 ng / mlのciliaryneurotrophic成長因子（CNTF）は、すべてのNeurobasal培地で希釈し、氷上で調製し、同じ日に使用。培地10mlを胚スライスの20ウェルのために必要です。 2。ニワトリ胚の準備彼らは15 24を上演するために開発するまで、場所は38で強制通風イン ​​キュベーター内で水平方向に長い辺°Cの鶏の卵を受精。これは通常のインキュベーションは、約4日を要します。 インキュベーションの二日目に、70％エタノールに浸したティッシュペーパーで拭いて卵の殻を殺菌。慎重にピアス5 mlシリンジに取り付けられており、アルブミンの5ミリリットルを取り除く21ゲージの針を用いて卵の殻の平らな端。シェルを開いたときに胚が損傷していないので、これが離れてシェルから胚を下げる。インキュベーターに卵を返し、さらに2日間のためにそれらをインキュベートする。 鈍いデュモン＃5鉗子cを用いてarefullyピアスシェルの上部中央とシェルの9 cm 2の周りに取り外します。胚の周りにカットし、慎重に解剖中にHBSS中に胚と場所を持ち上げて外します。胚はハンバーガーとハミルトン（1992）15によると上演されるべきである。使用した全ての胚はステージ24に​​近い速度でなければなりません。異常の兆候を示し、任意の胚は破棄されるべきである。 羊膜、絨毛膜尿膜、ヘッド、2デュモン＃5鉗子を用いて尿膜を取り除きます。すべての内臓を除去するために胚を骨抜きにする。これを行うには、ミクロ解剖ハサミで胚の腹側正中を切開する鉗子の1ペアで吻側トランク領域の周囲に胚を保持、腸、心臓の吻側部分をつかむと尾側に引っ張る。それは、これがきれいに行われることが重要である。あなたは、胚は体節はっきり見ることができるはずです。横方向胸部ボディをトリムアッパーと下肢buds.Now間、半分に胚をカット顕微解剖ハサミを使用して壁。 3。胚スライス標本水浴からアガロース溶液を除去します。使い捨ての3ミリリットルプラスチックパスツールピペットの底から5cmを切った。 乾いたシャーレ内解剖ソリューションと場所のクレードル胚を実施するために2つの鉗子を用いて解剖した胚の腰椎半分を削除します。パスツールピペットを用いて、胚の上、アガロースの2ミリリットルの周りにピペット約0.5mlを削除してからピペットに胚のスライスを吸う。プラスチック金型は、アガロースで任意の気泡を導入しないように世話をはがすに胚およびアガロースを転送します。そっと下向き胸部セクションが付いているプラ​​スチック金型でアガロースの底に胚を下げる。胚はストレート21ゲージ針を使用しているように配置されるべきである。スライスはまた、発展途上四肢の一部が含まれますし、それが重要である寒天での胚の向き大証はこれを許可します。アガロースを設定するには、氷の上にボートを配置します。胚が（2分前後）、この期間中に向きを変更しないよう注意してください。 ライカVT1000Sビブラトーム（スピード3、周波数4、厚さ400μmのスライスが）スライス室HBSSで充填され、氷のように冷たい水に囲まれたを使用して設定されるべきである。アガロースブ​​ロックは、スーパー接着剤でビブラトームプラットフォームに貼り付いている。アガロースブ​​ロックは、それを取り巻くアガロース1-3のmmの胚の部分を残すようにカミソリの刃でトリミングされています。明確な外胚葉性頂rigdeと肢芽のセクションを含むスライスが選択され、これらのスライスは、その後、HBSS中に配置されます。一般的に、胚あたりわずか1〜2つの適当なスライスがあります。穏やかに2本の針を用いて組織切片の周囲にアガロースを削除します。それは、これが徹底的かつ慎重に行われていることが不可欠です。 4。培養胚スライス requirに培養液500mlを（上述）を追加24ウェル超低付着扱わ組織培養プレートのウェルのED番号。ウェルにHBSS溶液から慎重にスライスを転送します。一般的に、我々は各ウェルで二から三スライスを用意してみてください。 24時間、5％CO 2で37℃で組織培養インキュベーター中で24ウェルプレートを置きます。 5。免疫染色のスライスをセクショニング培養期間の後、胚スライスの各ウェルにバッファリングされていない修正の500μlを添加し、氷上で20分間のままにしておきます。トータルソリューションを慎重に除去し、PBSで3回洗浄を5分間隔で行われています。スライスはその後6時間のまわりに、スライス·シンクまで、4℃でのショ糖溶液に残されていますが（ 例えば一晩）長く放置することができます。 20℃で余分なスクロース溶液オフスライスとDABを削除して、約5分間の周りに1ミリリットル10月に平衡はぐ10月に満ちたプラスチック金型の各スライスフラットをマウントします。マウントした後、固化させる垂直にドライアイス上に金を置く。 クライオスタットに10月のブロックをマウントし、約20分間-24℃でブロックを平衡化します。 Superfrostプラススラ​​イド上にマウント15ミリメートルのセクションで、それぞれのスライスを切った。それらが必要になるまでスライドは-80℃で保存することができます。 6。免疫蛍光室（我々はオートクレーブテープで固定し、1または2 mlプラスチックピペットを使用）の底から隆起したスライドを使って加湿チャンバーで開催された水平方向のスライド上のPBSピペット1〜2ミリリットル。 °過剰OCTはスライドからのPBS溶液を除去し、セクションの上にブロック溶液500mlを追加、削除するためのC、20℃で30分間インキュベートする20℃で5分間、PBS中のセクションをインキュベートブロック溶液を除去し、直ちに希釈した一次抗体の500ミリリットルを追加°Cで18から22時間、4℃でインキュベートし、スライドに追加しました。 一次抗体溶液を除去して、すぐにあった時間20℃で5分間、3回1mlのPBSでスライド°Cの過剰な一次抗体溶液を除去した。セクションの上に希釈した二次抗体の500ミリリットルを追加します。次いで、スライドを30分間20℃で放置されています。二次抗体溶液を除去し、スライドは20℃でPBSで3回5分間洗浄し、 これらの洗浄に続いて、最後のPBSで洗浄、DAB過剰のPBSを除去し、スライドの端を取り外し、スライド上vectashield 2滴を加え、穏やかに気泡形成を回避し、セクションの上にカバーガラスを築く。イメージを作成する前にスライドの端からブロッティングにより過剰Vectashieldを削除します。 7。イメージング免疫染色画像のセクションを。我々はHamammatsu ORCA ERデジタルカメラ、10、X、20Xと40 Xの対物レンズを搭載したニコンのEclipse E80i蛍光顕微鏡を使用しています。