닭의 배아 척수 코드 슬라이스 문화 프로토콜
Summary
슬라이스 문화 유전자와 약리 섭동에 의해 배아 개발의 조작을 용이하게합니다. 그러나, 문화 조건은 일반적인 개발 슬라이스의 감소 환경 내에서 수행 할 수 있는지 확인해야합니다. 우리는 최소 24 시간 동안 진행되는 것이 정상적인 척추의 개발을 용이하게하는 프로토콜을 보여줍니다.
Abstract
슬라이스 문화 모두 pharmacologically 및 유전자 조작을 통해 배아 개발의 조작을 용이하게 할 수 있습니다. 이 감소 시스템에서 전신 약물 응용 프로그램으로 인해 잠재적 인 치명적인 부작용을 극복 할 수 있습니다. 그러나, 문화 조건 슬라이스의 감소 환경 내에서 일반적인 개발 진행을 확인해야합니다. 우리는 특히 척추 모터 뉴런의 것을 척수의 개발에 초점을했습니다. 우리는 체계적으로 대부분의 척추 운동 뉴런이 탄생 된 시점에서 닭 배아 슬라이스 문화 조건을 다양한. 우리는 생체에 해당에 비해 문화 기간 및 그 모터 뉴런의 위치 동안 살아 모터 뉴런의 수와 유형을 assayed. 우리는 혈청 유형과 neurotrophic 요인은 문화 기간 동안 필요했다 발견 최소 24 시간에 모터 뉴런이 살아 유지하고있는 모터 뉴런이 적절한 위치로 마이그레이션 할 수 있도록 할 수있었습니다척추. 우리는이 문화 조건 및 아가로 오스에 포함 eviscerated 닭 배아를 사용하여 배아 슬라이스 문화를 준비하는 방법을 제시하고 vibratome를 사용하여 썰어.
Introduction
정상적인 배아 발달 동안, 많은 다른 세포 유형은 원산지 자신의 관점에서 그들은 결국 성숙한 유기체에서 작동합니다 위치로 마이그레이션해야하는 생성됩니다. 개발 척수 내 전구 세포는 중간 선에서 심실 지역에 위치해 있으며, 감각 처리와 모터 출력 1 필요한 기능 neuronal 회로로 통합 마이그레이션해야합니다 postmitotic의 뉴런과 glial 세포의 여러 하위 유형을 생성합니다. 사지 근육의 수축을 제어 척수 모터 뉴런은 광범위하게 연구되었으며 대부분 서로 다른 서브 클래스의 형성을 유도 분자 및 메커니즘의 알려져 있습니다. 그러나, 훨씬 덜은 모터 뉴런이, 마이그레이션 분리 및 신경 입력을받을하여 메커니즘을 알려져 있습니다.
모터 신경 세포의 하위 유형의 신원은 계층 적 방식으로 개발되는 동안 획득 한 것입니다. 모터 신경 세포의 하위 유형은 크게 전을 분류 할 수 있습니다n 인물 별개의 열, 그들의 축삭의 계획에 의해 정의 된 부서 및 수영장. 축, 내장 또는 다리 근육 중 하나에 모터 열 프로젝트 axons합니다. 자동차 부문은 복부 나 등쪽 근육에 2를 투영 사람들에 측면 모터 열 (LMC)의 모터 뉴런을 투영 다리를 나눌. 부서 내에서 모터 뉴런의 클러스터는 다리 2, 3에서 개별 근육에 모터 풀 프로젝트를 칭했다. 사업부 신분이 homeodomain 전사 인자 췌장-1 (ventrally 투영) 또는 Lhx-1 (dorsally 예상) 6의 표현을 특징으로하는 반면, 사지 – 돌출 모터 뉴런은 전사 인자 Foxp1 4, 5 자신의 표현에 의해 정의됩니다. 사실, Lhx-1 표현은 모터 뉴런 7 적절한 등쪽의 예측이 필요합니다. 이러한 하위 유형의 각 척수 내에서 독특한 위치를 차지하고, 복부 돌출 모터 뉴런은 dorsally projecti에 안쪽 거주하는 온NG 모터 뉴런. LMC의이 결과는 소위 LMCmedial (LMCm)와 LMClateral (LMCl) 부문으로 분리된다. 사업부 및 모터 수영장 조직은 두 단계 8에 인수되어 있습니다. 첫 번째 단계에서 사업부 분리는 수평 패션에 대한 중간 특성의 모터 뉴런의 마이그레이션을 통해 달성된다. LMCl 세포는 LMCl는 최종 침전 위치를 달성하기 위해 LMCm을 통해 마이그레이션하기 때문에 LMCm 세포와 후 생성됩니다. 두 번째 단계는 모터 뉴런의 등쪽 – 복부 정렬을 통해 추측 컨데, 모터 뉴런 풀에 부서와 클러스터 그들 안에 모터 뉴런이 소요됩니다. catenin에 의존 클래식 cadherin 가족 회원은 모터 신경 조직 8-10의 두 단계에 중요한 것으로 표시되었습니다. 그러나, cadherin 기능은 세포의 움직임을 제어하는 방법을 제대로 이해된다.
원주, 사업부 및 수영장 정체성의 인수 외부 신호를 필요로하는 패턴 intrinsi전사 인자 11의 C 표현. 또한 모든 모터 뉴런의 50 % 정도는 주로 모터 신경 세포의 생존의 neurotrophic 지원을 통해, 다리에서 외부 신호를 필요로하는 과정에서 정상적인 개발 중에 apoptosis를 통해 죽어. 따라서, 모터 신경 세포 개발은 비교적 긴 timecourse으로 유지 될 수있는 적절한 환경이 필요합니다. 이러한 이유로, 모터 신경 세포의 생존을 유지하기 위해 척추의 슬라이스 문화를 생성하는 practicalities 적절한 문화 조건의 해설을 필요로합니다. 이전 배아 슬라이스 문화는 neuronal 인구에게 12-14를 extrinsically 추가 정화의 동작을 따라하는 데 사용되었습니다. 그러나, 슬라이스 자체 내에서 현장 모터 신경 세포의 생존 및 마이그레이션에 용이하게 지식 문화 조건에 게시되지 않았습니다. 우리는 정화의 생존을 촉진하는 표준 문화 조건을 수정, dissociated 두개골 모터 뉴런이 m을 촉진하기 위해배아 슬라이스 문화 시스템 내의 otor 신경 세포 개발. 우리는 또한 생존 모터 뉴런의 위치를 모니터링하고 모터 뉴런 부서의 대부분이 정상적인 위치는 문화 기간 동안 획득 한 것을 보여줍니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
여기에 설명 된 프로토콜은 닭 배아 슬라이스가 모터 뉴런이 살아 있도록하고 문화 기간 동안 마이그레이션을 계속하면서 하루 이상 incubated 할 수 있습니다. 모터 뉴런이 살아 유지 조건을 elucidating에서, 우리는 필요한 몇 가지 주요 기능을 확인하고 있습니다. 그것은 최대 4 %의 여자의 혈청은 모터 뉴런과 다른 종의 혈청과의 교환의 생존에 중요 용납되지 않습니다 것 같습니다. 흥미롭게도, 우리는 혈청보다 높은 농도의 존재들이 슬라이스 모양의 총 왜곡로 이어지는 조직의 전면에 자라 난을 추진 같이 조각에 해로운 사실을 발견했습니다. 더 중요한 건, cilliary neurotrophic 요인의 존재도 중요이었다. 이 조각은 심지어 척수로 감각 수입 성의 입력의 시각화를 허용, 단 24 시간보다 훨씬 더 기간 동안 배양 할 수있을 수 있다는 독특한 가능성이 남아있다. 또한 막여기 진짜야 조건은 또한 개발 brainstem과 midbrain / 소뇌의 문화를 썰 유용 할 수 있습니다.
아마도 이러한 슬라이스 문화 조건의 사용에서 가장 큰 잠재적 인 혜택은 그러한 마음으로 배아의 나머지 부분에 부정적 영향에 대한 가능성을 최소화하면서 단백질 기능의 약리 조작에 대한 가능성을 촉진한다는 것입니다. 다른 신호 경로의 억제제와 agonists의 많은 수는 다른 척추 신경의 하위 유형의 마이그레이션하고, 잠재적으로, 개발 기간 동안 지역의 척추 회로의 형성에 미치는 영향을 평가하는 데 사용할 수 있습니다. 또한, 이러한 siRNAs 및 morpholino의 oligonucleotides의 사용을 만든 것과 같은 단백질 표현의 일부 유전자 섭동은, 그들 만 초기 개발에 도입 (비켜 electroporation 절차에의 제한하기 때문에)와에 대한 효과는 마지막으로 할 수있는 사실로 고통 팀의 짧은 기간E (보통 한 일). 우리 슬라이스 문화는 나중에 단계에서 시작하며 슬라이스의 문화의 기간 동안의 효과를 볼 수 썰기 단계에서 나중에 개발에이 기술을 사용할 수있는 가능성을 갖게된다.
슬라이스 문화 프로토콜은 모두 척추 운동 뉴런뿐만 아니라 시간 경과 비디오 현미경을 통해 실시간으로 등쪽 interneuron 이주의 시각화를 허용 할 수 있습니다. 이것은 하얀 빛 아래 또는 형광 이미징을 사용하여 위상 대비 현미경을 사용하여 달성 할 수 있습니다. 후자 기술 한 다음 사용한다면 형광 라벨의 도입이 필요합니다. 이것은 뇌실이나 뉴런의 집합에 형광 단백질을 유도 할 수 구조의 비켜 electroporation에있는 다리 또는 anterograde 라벨에서 역행 라벨 중 하나를 통해 이러한 DiI 또는 디오와 같은 형광 염료의 도입에 의해 하나 달성 할 수 있습니다.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 Foxp1에 항체의 종류 선물에 대한 많은 통찰력 토론 및 B. Novitch에 대한 샤론의 자랑을 감사드립니다. KCT 할 수있는 웰컴 트러스트에서 학생이기와 웰컴 트러스트에서 SRP (권한 부여 참조 번호 094399/B/10/Z)에 프로젝트 교부금으로 운용로 작동합니다.
Materials
| Eggs | Henry Stewart Farms, UK | Fertilised Brown Bovan Gold Hen’s eggs (Henry Stewart Farms, UK), stored at 14 °C until incubation | |
| 21 Gauge needle | BD-Microlance-3 | 304432 | |
| 5 ml syringe | BD Plastipak | 302187 | |
| #5 Dumont forceps | Roboz | RS 5045 | |
| Micro Dissecting scissors | Roboz | RS 5910SC | (3.5 in straight) |
| Embryo embedding moulds: Peel away moulds | Agar Scientific | G3764 | Pyramidal shaped 22 mm to 12 mm |
| Super glue | Power Flex, Loctite | ||
| Ethanol | SIGMA | 32221 | |
| Sodium di-hydrogen Phosphate, mono-hydrate | BDH | 102454R | |
| Di Sodium mono-hydrogen Phosphate | VWR/ BDH | 102494C | |
| Sodium Chloride | VWR/BDH | 27810.295 | |
| Low melting temperature agarose | Invitrogen | 16520 | |
| Fetal Bovine serum | Gibco | 10500-064 | |
| Triton X-100 | SIGMA | T8787 | |
| Sodium Hydroxide | FLUKA | 71689 | |
| Paraformaldehyde | VWR/BDH | 28794.295 | |
| Plastic disposable pasteur pipettes | ElKay Precision laboratory consumables | 127-P503-000 | Liquipette 3 ml volume |
| Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) | Gibco | 14170 | |
| Sucrose | SIGMA | S0389 | |
| Sodium Hydrogen Carbonate | SIGMA | S5761 | |
| Chicken Embryo Extract | Seralabs | CE650-J | |
| Penicillin/ Streptomycin solution | Gibco | 15070 | |
| L-Glutamine solution | Gibco | 25030 | |
| 2-mercaptoethanol | Gibco | 21985 | |
| Horse serum | Southern Group Labs | 9028B | |
| B27 supplement | Invitrogen | 17504-044 | |
| Neurobasal medium | Gibco | Cat ~ 2103 | |
| CilliaryNeurotrophic factor (CNTF) | R and D Systems | 557-NT-010 | |
| Chick Serum | SIGMA | C5405 | |
| Primary antibodies | were purchased from Developmental Studies Hybridoma Bank, with the exception of anti-foxP1 antibodies, which were a kind gift from Bennett Novitch of UCLA. Primary antibodies dilutions were Rabbit anti-FoxP1 (1/32000), Mouse anti-Lhx1/2 (4F2) (1/50), Guinea Pig anti-FoxP1 (1/1000). All antibodies were stored at 4 °C. |
||
| Secondary antibodies | Donkey anti-Guinea Pig (cy3) (1:1000) purchased from Jackson Immunoreseach Laboratories Inc. Donkey anti-Mouse (Alexa Fluor 488) (1:1000), Donkey anti-Rabbit (Alexa Fluor 594) (1:1000) purchased from Invitrogen All antibodies were stored at 4 °C. |
||
| 24-well plate | Corning COSTAR | 3473 | ultralow attachment 24-well plate |
| O.C.T. | Tissue Tek, Sakura | 4583 | Optimum Cutting Temperature |
| Vectashield | Vector Labs | H1000 | Vectashield fluorescent mounting medium |
| Slides | Thermo Scientific | Superfrost-Plus positively-charged slides, 25 x 75 x 1.0 mm | |
| Cover Glass | VWR International | 631-0167 | 25×60 mm |
| Forced draft incubator: | Lyon Electric Company | kept humid by ensuring water levels always sufficient, maintained at 38 °C | |
| Cryostat | Brite, Huntingdon, UK | -36 °C | |
| Tissue Culture Incubator | DH Autoflow | Nuaire 38 °C, 5% CO2 | |
| Vibratome | Leica | Leica VT1000-S | |
| Microscope | Nikon | Nikon Eclipse E80i fluorescence microscope | |
| Digital Camera | Nikon | Nikon DS5M and Hamammatsu ORCA ER |
References
- Jessell, T. M. Neuronal specification in the spinal cord: Inductive signals and transcriptional codes. Nature Reviews Genetics. 1 (1), 20-29 (2000).
- Landmesser, L. Distribution Of Motoneurons Supplying Chick Hind Limb Muscles. Journal of Physiology-London. 284, 371-389 (1978).
- Romanes, G. J. The motor pools of the spinal cord. Progress in Brain Research. 11, 93-119 (1964).
- Dasen, J. S., De Camilli, A., Wang, B., Tucker, P. W., Jessell, T. M. Hox repertoires for motor neuron diversity and connectivity gated by a single accessory factor, FoxP1. Cell. 134 (2), 304-316 (2008).
- Rousso, D. L., Gaber, Z. B., Wellik, D., Morrisey, E. E., Novitch, B. G. Coordinated actions of the forkhead protein Foxp1 and Hox proteins in the columnar organization of spinal motor neurons. Neuron. 59 (2), 226-240 (2008).
- Tsuchida, T., Ensini, M., et al. Topographic organization of embryonic motor-neurons defined by expression of limhomeobox genes. Cell. 79 (6), 957-970 (1994).
- Kania, A., Johnson, R. L., Jessell, T. M. Coordinate roles for LIM homeobox genes in directing the dorsoventral trajectory of motor axons in the vertebrate limb. Cell. 102 (2), 161-173 (2000).
- Price, S. R., Garcia, N. V. D., Ranscht, B., Jessell, T. M. Regulation of motor neuron pool sorting by differential expression of type II cadherins. Cell. 109 (2), 205-216 (2002).
- Demireva, E. Y., Shapiro, L. S., Jessell, T. M., Zampieri, N. Motor Neuron Position and Topographic Order Imposed by β- and γ-Catenin Activities. Cell. 147 (3), 641-652 (2011).
- Bello, S. M., Millo, H., Rajebhosale, M., Price, S. R. Catenin-Dependent Cadherin Function Drives Divisional Segregation of Spinal Motor Neurons. Journal of Neuroscience. 32 (2), 490-505 (2012).
- Haase, G., Dessaud, E., et al. GDNF acts through PEA3 to regulate cell body positioning and muscle innervation of specific motor neuron pools. Neuron. 35 (5), 893-905 (2002).
- Hotary, K. B., Landmesser, L. T., Tosney, K. W. Embryo slices. Methods in Cell Biology. 51 (51), 109-124 (1996).
- Hotary, K. B., Tosney, K. W. Cellular interactions that guide sensory and motor neurites identified in an embryo slice preparation. 发育生物学. 176 (1), 22-35 (1996).
- Krull, C. E., Tosney, K., Bronner-Fraser, M. Embryo slices and strips: Guidance and adhesion assays in the avian embryo. Methods in Cell Biology: New Methods in Avian Embryology. 87, 97-113 (2008).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. (Reprinted From Journal Of Morphology, Vol. 88, 1951). Developmental Dynamics. 195 (4), 231-272 (1992).
- Rakic, P. A century of progress in corticoneurogenesis: From silver impregnation to genetic engineering. Cerebral Cortex. 16, I3-I17 (2006).
- Bingham, S. M., Sittaramane, V., Mapp, O., Patil, S., Prince, V. E., Chandrasekhar, A. Multiple mechanisms mediate motor neuron migration in the zebrafish hindbrain. Dev. Neurobiol. 70 (2), 87-99 (2010).
- Brachmann, I., Jakubick, V. C., Shaked, M., Unsicker, K., Tucker, K. L. A simple slice culture system for the imaging of nerve development in embryonic mouse. Developmental Dynamics. 236 (12), 3514-3523 (2007).
- Das, R. M., Wilcock, A. C., Swedlow, J. R., Storey, K. G. High-resolution Live Imaging of Cell Behavior in the Developing Neuroepithelium. J. Vis. Exp. (62), e3920 (2012).
- Barnes, S. H., Price, S. R., Wentzel, C., Guthrie, S. C. Cadherin-7 and cadherin-6B differentially regulate the growth, branching and guidance of cranial motor axons. Development. 137 (5), 805-814 (2010).
