嵌入后突触蛋白的免疫标记海马切片培养

在亚细胞水平研究生物分子免疫电镜是一个功能强大的工具。耦合到电子致密如胶体金标记的抗体，可以揭示在各种组织中的特定的抗原¹的定位和分布。两个最广泛使用的技术是预嵌入和嵌入后的技术。在预嵌入免疫金电子显微镜（EM）技术中，组织必须透性以允许抗体渗透之前，它被嵌入。这些技术是理想的保护结构，而且渗透力差的抗体（通常只有几微米）是一个很大的缺点^2。后嵌入标记方法可以避免这个问题，因为标签上发生的部分固定的组织抗原更容易获得。多年来，多次修改，完善后的嵌入方法，以提高免疫，并保留超微结构<suP> 3-5。

组织固定EM研究的重要组成部分。固定剂的化学交联的大分子锁定的组织结构。固色剂的选择不仅影响结构保存，但也抗原性和对比度。几十年来，四氧化锇（OSO _4），甲醛，和戊二醛已被标准的固定剂，包括中枢神经系统（CNS）的组织，尤其是在化学和物理处理过程中容易产生结构损伤。不幸的是，OSO ₄是反应性高的，并已被证明，以掩盖抗原^6，从而导致在穷人和不足的标签。替代方法来避免化学固定，包括冻结的组织。但是，这些技术是难以执行，并需要昂贵的仪器。为了解决这些问题中的某些问题，并提高CNS组织标签，Phend 等 。 OSO ₄醋酸铀（UA）和单宁的ACI代替D（TA），并成功地引入了额外的修改，以提高抗原检测的敏感性和结构保存在大脑和脊髓组织^7。我们都采用了这种锇后埋线法对大鼠脑组织和优化的探测和研究突触蛋白的免疫胶体金标记技术。

我们在座的方法来确定大鼠海马CA1锥体神经元突触蛋白的超微结构定位。我们使用海马切片培养的切片。这些切片保持的trisynaptic的的电路的海马，从而学习突触可塑性是特别有用的，一个机制，人们普遍认为，学习和记忆的基础。如前所述^8，可以制备从出生后的第5和6天小鼠/大鼠幼仔器官型海马切片，以及急性击倒或过度表达的外源蛋白是特别有用的。我们以前使用过该协议的通道aracterize的NG（NG），神经元特异性蛋白的关键作用，在调节突触功能^8,9。我们还用它来 ​​描述的超微结构定位钙调素（CAM）和Ca ^{2 +} /钙调素依赖性蛋白激酶^{II（CaMKII）10。}所示的结果，该协议允许的树突棘超微结构的保存和高效的标签，吴，，帮助刻画其分布在脊柱^8。此外，这里所描述的过程可以有广泛的适用性，在研究参与神经元功能的许多其他蛋白质。