당뇨병 연구에서 β-세포 질량 분포의 평가를위한 적외선 광학 프로젝션 단층 촬영 부근
Summary
우리는 광학 프로젝션 단층 촬영 (OPT)의 적응을 설명<sup> 1</sup> 가까운 적외선 스펙트럼 및 전산 도구의 숫자의 구현에 이미지 있습니다. 이 프로토콜은 큰 표본에서 췌장 β 세포 질량 (BCM)의 평가를 활성화 기술의 채널 용량을 증가시키고 OPT 데이터의 품질을 향상시킬 수 있습니다.
Abstract
가까운 적외선 (NIR) 스펙트럼 이미징의 기능을 포함 OPT을 조절함으로써, 우리는 여기서 이러한 쥐의 췌장 등의 췌장 조직의 이미지를 큰 기관에 가능성을 설명하고, 채널의 수 (셀 유형) 5 월을 높이기 위해 단일 표본에서 공부합니다. , 게시물에 대한 2 / 개선 알고리즘 표본의 (우리의 경우에 췌장) 회전 축에서 질량 중심 (COM) (AR) 2의 1 / 정확한 위치 : 우리는 더 이상 제공 계산 도구의 숫자의 구현을 설명 – 정렬 단층 재건 2, 3 / OPT 기반 BCM의 결정 3 노이즈 비율로 신호를 높이기 위해 강도 균등화를위한 프로토콜 동안 기하학적 왜곡을 방지 튜닝. 또한, 우리는 이미지 수집하는 동안 표본의 의도 움직임에 대한 위험을 최소화 샘플 홀더를 설명합니다. 함께,이 프로토콜은 BCM 유통 및 oth의 평가를 가능하게어 기능 Langerhans의 개별 섬의 수준에 해상도로, 그대로 pancreata 또는 다른 장기 (췌장 이식의 연구에 등)의 볼륨을 통해 다운을 수행 할 수합니다.
Introduction
β-세포를 생산 인슐린은 혈당 항상성을 제어 할 수있는 신체의 능력에 대한 열쇠입니다. 따라서 췌장 BCM 분포의 평가는 사전 임상 당뇨병 연구의 여러 분야에 필수적입니다. 예를 들어, 치료 정권의 평가에서, 질병에 대한 쥐 모델에서 내분비 세포 분화 또는 당뇨병 aetiology 연구에 타겟팅 된 유전자 절제의 영향은 종종 이러한 분석에 따라 달라집니다. 전통적으로, 평가 이러한 종류의 크기와 췌장의 복잡한 해부학 적 헌법으로 인해 수행하기 어려운 시간이 소요 stereological 접근 방법에 의존하고 있습니다. 현재의 대부분의 고해상도 이미징 방법은 (일반적으로 광학), 설치류에서 전체 췌장 이미징을 허용하기에 충분한 침투 깊이를 제공하지 않습니다. 반대로, 자신의 침투 깊이 (일반적으로 핵)에 의해 제한되지 않습니다 이미징 접근 방식은 전체 BCM 분포를 해결하기 위해 가난한 해상도로 제공하고 방해4,5 적절한 대비 요원의 부족에 의해.
광학 프로젝션 단층 촬영은 cm 규모 6 mm에 생명 표본의 고해상도 평가를 수있는 3D 영상 양상이다. 이에, 공간적 위치와 Langerhans의 섬을 표현 개인 인슐린의 볼륨에 대한 정보는 정상과 당뇨병 생쥐 3,7-10에서 췌장의 볼륨에 걸쳐 추출 할 수 있습니다. 현재 연구의 목적은 더 췌장 β-세포의 평가를위한이 기술의 능력을 향상하는 것입니다, 다른 조직, 다른 췌장 성분 (예 : 셀 형식을 침투 등)과의 관계에 대형의 이식의 내생 배포, 이전에 가능한 것 췌장 준비.
가까운 적외선 광학 프로젝션 단층 촬영 (NIR-OPT) 설치
프로토콜, 최대 샤프에 의해 설명 원본 설정에 따라 OPT 스캐너 아래에서 <e가까운 적외선 범위에서 영상에 적응 m> 외 1, 설명 및 사용됩니다. 마우스 췌장 (BCM의 예)의 단일 채널 평가를 들어, SkyScan 3001 (Bioptonics) 스캐너를 사용할 수 있습니다.
650nm 위의 파장에서 수은 아크 램프보다 높은 여기 에너지를 제공하는 금속 할로겐화물 램프는 여기 빛을 공급하고 있습니다. 빛이 액체 빛이 가이드를 통해 전송됩니다. fluorochromes 및 NIR 형광 이미징 및 채널 분리 밴드 패스 필터의 유용한 조합은 그림 3에 표시됩니다. 방출 빛이 NIR 스펙트럼에서 높은 양자 효율, 다시 조명 CCD 카메라로 검출된다. OPT 스캔은 카메라를 제어 LabView 플랫폼 및 스테퍼 모터를 사용하여 자동화되어 있습니다. 그대로 쥐 pancreata, 보호 코팅은 거울 및 대형 큐벳의 크기 샘플을 지원하는 것은 사용됩니다. 마지막으로, 샘플 홀더 원치 않는 수직 movemen을 제거 그스캔하는 동안 샘플의 TS가 설계되었습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
OPT 이미지에 대한 설명 기술 손쥐 췌장의 볼륨을 통해 공간 및 정량 매개 변수 추출 할 수 있습니다. mesoscopic 이미지 그것의 유형에 달성 해상도의 제한으로 인해 주목해야한다, 대부분의 이미징 modalities뿐, 큰 표본 낮은 해상도 (높은 해상도 CCD의 사용 OPT 스캔의 해상도를 증가해야하지만) . 따라서, 손상 췌장 마우스 엽의 평가에 대해, 현재의 기술은 비록 가까이 (약 15-20 μm) 7 단세포 해상도를 제공하지 않습니다. 하지만, 마우스 췌장에서 BCM 분포의 추출을위한 프로토콜은 잘 morphometry 3,13를 계산 예를 들어 포인트 획득 일치 이상 이것은 주목해야하는 데이터를 제공 한 CLAHE 프로토콜의 구현은 훨씬 더 많은 섬의 검출이 가능하지만, 이 섬은 일반적으로 작은 및 contribu하지테는 실질적으로 전체 β-세포 볼륨합니다.
참여 immunohistochemical 프로토콜 (최대 2 주) 비교적 긴하지만, 표본 준비 시간에 실제 손은 짧고 따라서 기술이 잘 동물 9 큰 무리들이 연구에 적합이다. heterogenic 유통 패턴의 가능성이 조사를 위해 초점을 경우, 그 치료는 고정에 관한 및 췌장 조직이 불리한 방식으로 고정되고, 평면 ( "분산"라고 방지하기 위해 설치 단계에서 촬영해야한다고 강조한다 조직의) 마운트는 이러한 평가를 용이하게 할 수 있도록 노력하여야한다.
OPT를 수행 중요한 문제는 샘플의 COM은 회전 축에 고정하고 스캐닝 절차를 수행하는 동안, 각 수직 또는 수평으로 움직이지 않는 점이다. 따라서이 attachi을위한 안정적인 기계 설치 및 잘 작동 시스템을 가지고 필수적입니다NG 샘플. 우리는 새로운 마운트 (그림 7)를 구성하여이 문제를 해결.
병렬 구조는 우리 NIR-OPT 또는 뒷면과 기록 투영 이미지의 주변 물체의 앞에 위치 사이의 수직 변화로 감지되었습니다 Bioptonics 3001 스캐너에 대해 사실이 아닌. (2.3.1 참조) 각 스캐너의 로그 파일에 소스 거리에 객체를 조정함으로써 우리는 크게 우리의 데이터의 품질을 향상시킬 수 있으며 특히 중요하다 투영 이미지의 맨 가장자리에 기하학적 왜곡에 대한 수정하면 큰 표본을 평가.
현재 프로토콜에서 우리는 세 가지 특정 채널과 그대로 췌장 준비를 평가에 "해부학"채널의 시각화를 허용 필터 세트의 제안을 제공합니다. 분명히 이러한 설정은 fluores 모든 형태의과 마찬가지로 더 나은 비록 주어진 연구에 활용 fluorochromes에 맞게 조절 될 수센트 현미경은 신호 블리드 – 스루의 가능성 위험을주의 깊게 평가해야합니다. 750 나노 미터보다 기쁘게 생각합니다 fluorochromes과 인슐린이라는 섬의 연구는 아직 우리의 세트가 활용되는 금속 할로겐화물 램프를 사용하여 당사 수 없었습니다. 그것은 다른 광원 (예 : 다이오드 레이저)와 함께 해당 파장에서 더 높은 양자 효율 카메라가 더 NIR-OPT의 가능성을 높이고 더 높은 파장에서 이미징 할 수 있도록 수 수 있습니다.
OPT 영상은 mm-cm 규모의 생물 의학 표본의 공간 및 정량 평가를위한 매우 다양한 기술입니다. 여기에 제시된 프로토콜 췌장 / 당뇨병 연구의 주요 목적으로 개발되었습니다 있지만 그들은 다른 종, 표본 유형 및 마커에 대한 연구로 번역 할 수 있어야한다. NIR-OPT 이미지 F, 그대로 췌장 준비에서 여러 별개의 채널을 시각화 할 수있는 가능성으로urther은 오래 대비 에이전트도 OPT에 의해 감지 형광를 운반하도록 설계 할 수 다른 이미징 modalities에 의해 비 침습적 평가를위한 대비 요원의 이해 특이성을 평가하는 도구로 잠재력을 보유하고 있습니다.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
박사 P.의 Lindström는 OB / OB 쥐를 제공하기 위해 인정하고 있습니다. J. Lehtonen는 편집에 도움 비디오 제작 및 J. 길버트와 도움을 인정합니다. (JS와 :이 연구는 당뇨병 연구소 재단 (AP), 아동 당뇨병 연구 재단 (AP 및 UA), 유럽위원회 (European Commission) (. CP-IP 228933-2 FP-7, 아니 부여 계약)의 보조금에 의해 지원되었다 UA), Kempe 재단, Umeå 대학과 UA로 스웨덴 연구 협의회
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| Methanol | Scharlau | ME03162500 | |
| 30% H2O2 | Scharlau | HI01362500 | |
| Benzyl Alcohol | Scharlau | AL01611000 | |
| Benzyl Benzoate | Scharlau | BE01851000 | |
| Low-meltingpoint agarose | LONZA | 50100 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D5879 | |
| Triton-X100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Mouse anti-aSMA-Cy3 | Sigma-Aldrich | C6198 | Primary antibody |
| Rabbit anti-CD3 | Sigma-Aldrich | C7930 | Primary antibody |
| Guinea Pig anti-Ins | DAKO | A0564 | Primary antibody |
| Donkey anti GP-IRDye680 | LI-COR Biosciences | 926-32421 | Secondary antibody |
| Goat anti Rb-DyeLight750 | Thermo Scientific | 35570 | Secondary antibody |
| Goat anti GP-Alexa594 | Molecular Probes | A-11076 | Secondary antibody |
| Goat anti GP-Alexa488 | Molecular Probes | A-11008 | Secondary antibody |
| Goat anti GP-Alexa594 | Molecular Probes | A-11012 | Secondary antibody |
| Goat anti GP-Alexa680 | Molecular Probes | A-21076 | Secondary antibody |
| Goat anti GP-Alexa750 | Molecular Probes | A-21039 | Secondary antibody |
| OPT Skyscan 3001 | Bioptonics | OPT-Scanner | |
| Leica MZ FLIII | Leica Microsystems | Stereomicroscope | |
| Leica Objective 0.5x | Leica Microsystems | 10446157 | |
| Leica Camera adapter 1.0x | Leica Microsystems | 10445930 | |
| EL6000 Metal Halide | 11504115 | Lightsource | |
| Liquid Light Guide | 11504116 | ||
| Cuvette | Hellma Analytics | 6030-OG | 55 x 55 x 52.5 mm |
| Mirror | Edmund Optics | F68-334 | 50 x 50 mm |
| Andor Ikon-M | Andor Technology | DU934N-BV | Back-illuminated CCD |
| Filterset | Chroma Technology | 41021-MZFLIII | TXR, Alexa-594, Cy3 |
| Filterset | Chroma Technology | 41022-MZFLIII | IRDye680, Alexa-680 |
| Filterset | Chroma Technology | 49037-MZFLIII | Dylight750, Alexa-750 |
| ProteinG-Sepharose beads | GE Healthcare | 17-0618-01 | Protein G Sepharose 4 Fast Flow |
| Sodium Azide | Sigma-Aldrich | 08591 | Sodium azide 0.1 M solution |
References
- Sharpe, J., et al. Optical projection tomography as a tool for 3D microscopy and gene expression studies. Science. 296, 541-545 (2002).
- Cheddad, A., Svensson, C., Sharpe, J., Georgsson, F., Ahlgren, U. Image Processing Assisted Algorithms for Optical Projection Tomography. IEEE Trans. Med. Imaging. , (2012).
- Hornblad, A., Cheddad, A., Ahlgren, U. An improved protocol for optical projection tomography imaging reveals lobular heterogeneities in pancreatic islet and beta-cell mass distribution. Islets. 3, 204-208 (2011).
- Holmberg, D., Ahlgren, U. Imaging the pancreas: from ex vivo to non-invasive technology. Diabetologia. 51, 2148-2154 (2008).
- Ahlgren, U., Gotthardt, M. Approaches for imaging islets: recent advances and future prospects. Adv. Exp. Med. Biol. 654, 39-57 (2010).
- Sharpe, J. Optical projection tomography. Annu. Rev. Biomed. Eng. 6, 209-228 (2004).
- Alanentalo, T., et al. Tomographic molecular imaging and 3D quantification within adult mouse organs. Nat. Methods. 4, 31-33 (2007).
- Alanentalo, T., et al. High-resolution three-dimensional imaging of islet-infiltrate interactions based on optical projection tomography assessments of the intact adult mouse pancreas. J. Biomed. Opt. 13, 054070 (2008).
- Alanentalo, T., et al. Quantification and Three-Dimensional Imaging of the Insulitis-Induced Destruction of beta-Cells in Murine Type 1 Diabetes. Diabetes. 59, 1756-1764 (2010).
- Sun, G., et al. Ablation of AMP-activated protein kinase alpha1 and alpha2 from mouse pancreatic beta cells and RIP2.Cre neurons suppresses insulin release in vivo. Diabetologia. 53, 924-936 (2010).
- Hornblad, A., Eriksson, A. U., Sock, E., Hill, R. E., Ahlgren, U. Impaired spleen formation perturbs morphogenesis of the gastric lobe of the pancreas. PLoS One. 6, e21753 (2011).
- Lindström, P. The physiology of the Obese-Hyperglycemic Mice (ob/ob Mice). The Scientific World JOURNAL. 7, 665-685 (2007).
- Bock, T., Pakkenberg, B., Buschard, K. Genetic background determines the size and structure of the endocrine pancreas. Diabetes. 54, 133-137 (2005).
