Введение в твердом носителе мембранный электрофизиологии

1. Настройка устройства для SSM основе электрофизиологии Подробности приводятся в двух наших технических публикаций, которые также содержат схемы и фотографии нашей кювет и создали 1, 2. Различные решения обмена конфигурациями и поток протоколов, также обсуждаются в нашем методе бумага 2. В дальнейшем мы добавим несколько последних усовершенствований и технических деталей, которые имеют прямое отношение к видео-презентации. Клапан управления и сбора данных Интерфейсный блок содержит коммерческую USB цифровой выход / аналоговый входной интерфейс (NI USB 6009 National Instruments) и клапан водителей. Она контролирует поток раствора и отвечает за сбор данных. Клапаны обычно управляется с 12 В. Тем не менее, для быстрого переключения клапанов может управляться с напряжением до 18 В. В видео мы используем 12 В источника питания. </P> Схема клапана доска водителя может работать четыре клапана. Он был изготовлен мастерской Макса Планка Институт биофизики. Клапаны можно управлять с помощью компьютера или вручную с помощью переключателей на передней панели. Последний является удобным для промывки и очистки-процедурами. Во время измерения, интерфейс окна управляется компьютером с помощью управляющего клапана и сбора данных программное обеспечение (2 R Surfe программного обеспечения, IonGate Biosciences). 2. Препараты В этом разделе различные протоколы для подготовки SSM основе экспериментов электрофизиологии упоминаются. 2.1 Выполнение липидов решение для формирования SSM Смешать 25 мкл Октадециламин (5 мг / мл в хлороформе) и 375 мкл Diphytanoylphosphatidylcholine (20 мг / мл в хлороформе) в стеклянный флакон. С помощью роторного испарителя и непрерывным потоком газообразного азота, выпаривают хлороформоколо 30 мин. Удалить липидов от стенки стеклянного флакона, встряхивая с 500 мкл н-декана. Конечную концентрацию липидов составляет 15 мг / мл с 1:60 (вес / вес) октадециламина. Перенесите раствор в пробирку для хранения стекла. Хранить липид раствор при -20 ° С. 2,2 Хлорирование электрода сравнения Электроды должны быть хлорированный равномерно из-за истирания. Удалить остальной старый слой хлорид серебра тонкой наждачной бумагой перед хлорированием процесса. Поместите серебряная проволока вместе с платиновым электродом в 1 М раствора соляной кислоты и хлорируют в течение 15 мин при 0,5 мА. После завершения хлорирования, серебряная проволока меняет свой цвет в однородную темно-серый. 2.3 Подготовка моста в полиакриламидном геле Готовят раствор, содержащий 100 мМ KPi при рН = 7, 100 мМ KCl и шесть% Акриламида. Добавить 0,3% APS (10% со) и 0,6% TEMED и вскоре перемешать раствор с помощью пипетки. Сразу же после смешивания раствора, использовать пипетку для введения 30 мкл смеси в пустой контейнер мост геля. Важно, чтобы избежать воздушных пузырей во время инъекции. Во время инкубации в течение 20 мин гель полимеризуется. После полимеризации гель мост хранится в растворе (100 мМ KPi рН 7, 100 мМ KCl). Чтобы продлить срок службы гель моста раствор хранят при температуре 4 ° С. 2.4 Подготовка измерительной решения Из-за сильного взаимодействия растворенных веществ с SSM, электрические артефакты генерируются, когда растворов различного состава обмениваются. Таким образом, подготовка решений является важным шагом. Примите следующие меры предосторожности в процессе подготовки решения для минимизации артефактов решения обмена. Сделайте не-активация и активация решений от одной партии, отрегулировать рН и ионной силы. Высокий фон соль помогает уменьшить артефакты решение обмена. Разделить партию раствора в двух томах. Добавить активирующее соединение в активирующего раствора. Используйте компенсационные соединения в не-активирующих решение сохранить осмолярности и ионной силы обоих решений как можно более близкими. Если растворы хранили при 4 ° С, чтобы убедиться, что все решения до комнатной температуры перед началом измерений, так как даже небольшая разница в температуре может привести к артефактам. 3. SSM основе электрофизиологии эксперимент Здесь мы представляем типичный протокол для SSM основе электрофизиологических экспериментов. 3.1 Подготовка к установке SSM В то время как SSM установки не используется трубы заполнены 30% этанола/ Воды, чтобы избежать роста бактерий. Промыть система с чистой водой для удаления этанола от трубки до установки кюветы. Замените этанола емкости с водой контейнеров. Использование высокого давления (от 0,6 до 1,0 бар) очистки системы с 20-30 мл воды. Повторите процедуру очистки с использованием 100 мМ KPi буфере при рН 7,6 или не активизирующий раствор. Убедитесь в том, чтобы не было воздушных подушек внутри гидравлической системы. 3.2 Монтаж кювет Установите уплотнительное кольцо для электрода сравнения Возьмите гель мост из раствора для хранения и подключить электрода сравнения. Prefill выпускной патрубок с не-активирующий буфер, вставьте уплотнительное кольцо и соединить мостом гель для завершения сборки электрода сравнения. Соблюдайте особую осторожность, чтобы не было воздушных пузырьков не на стыке моста геля и выходной поток решением пути. Предварительную сборку основной части Cuveтет добавлением контактный пружинный контакт (подключение к усилителю), впускной трубы (соединение с терминалом клапан), уплотнительное кольцо (уплотнение для SSM) и винты. С помощью пинцета возьмите сенсорный чип из хранения раствора (10 мМ octadecanethiol в этаноле). С помощью пипетки, смыть оставшийся раствор с ок. 5 мл чистого этанола. Сушат электрода в атмосфере азота. Поместите сенсорный чип точно на базовой части кюветы так, что впускные отверстия основной части кюветы направлено на круговой рабочей области датчика. Добавить 1 мкл липидного решение активной области сенсорного чипа. Убедитесь в том, что золотой слой полностью покрывается за счет липидов. Сразу после добавления Раствор липида, закройте кювету добавлением предварительно собранный основной части. Перед монтажом кювету в клетку Фарадея, убедитесь, что все поверхности полностью высохли. КоннЕСТ усилитель с контактом пружинный контакт и впускной трубы к терминалу клапана. Затем установить кювету с помощью винтов внутри клетки Фарадея. Винт выпускной патрубок в верхней части кюветы. Наконец подключить выходной трубкой к разъему сети и напряжение генератора с эталонным электродом. Сразу после установки кюветы промывают систему с буфером при 0,6 бар. Это приводит к спонтанному образованию SSM. 3.3 Измерение параметров мембраны Для проверки качества ССМ, емкости и проводимости, оцениваются, используя функцию генератора. Используя функцию генератора, применяют 100 мВ напряжения постоянного тока для измерения проводимости. Рассчитать проводимость: затухание тока показан процесс зарядки мембранного конденсатора. После того, как конденсатор полностью заряжен измеренной текущей доходности мембранной проводимости с использованием закона Ома. Для простоты мы используем у.е.rrent 1 сек после подачи напряжения для вычисления проводимости G = I / U. Применение треугольного переменного напряжения 50 мВ от пика до пика амплитудой и частотой 0,5 Гц для измерения емкости. Рассчитать емкость: Амплитуда полученного квадратного текущий волна представляет токи зарядки конденсатора. Емкость С равна передается заряд Q = IΔt деленное AU = 100 мВ. (Аи в два раза приложенном напряжении 50 мВ, потому что разница ток положительной минус отрицательный наклон треугольного напряжения.) Мониторинг электрических параметров мембраны неоднократно каждые 10 минут в течение ок. От 30 до 40 мин, до достижения постоянного значения не будут достигнуты. Мытье между ними с KPi буфера при высоком давлении в диапазоне от приблизительно 0,6 до 1 бар. Оценка качества SSM: Оптимальные параметры находятся в диапазоне от 0,1 до 0,2 нс и от 2 до 3,5 нФ. Высокой проводимостью выше 0,8 нс, а низкая емкость 1 нФ ниже указываетSSM, что неправильно отформатирован. Высокую емкость выше 4 NF может означать, что активная зона не полностью покрыт SSM. Если параметры не в оптимальном режиме, мембраны должны быть отброшены, а другой ССМ подготовлены с использованием свежеприготовленного электрод чипа. 3.4 Проверка для обмена артефактами решения После мембраны параметры были проверены, измерительные буферы должны быть проверены на артефакты решение обмена. Вставьте соответствующие контейнеры решение гидравлической системы. Удалить пузырьки воздуха из гидравлической системы, используя ручные клапаны. Использование программного обеспечения сбора данных выбрал поток протокола, который вы хотите использовать в вашем эксперименте. Отрегулировать давление до 0,6 бар и начала измерений. Кроме механических артефактов переключающего клапана, в идеале токов артефакт не должно быть измерено, или они должны быть намного SMAМюллер, чем ожидаемые сигналы транспортного белка. Если артефакты решение обмена наблюдаются, пытаются оптимизировать буфера композиции и / или процедуры подготовки, прежде чем продолжить эксперимент. 3,5 Добавление образца белка Обычно протеолипосомы или фрагменты мембран хранили замороженными при -80 ° С. В одном измерении аликвоты приблизительно 30 мкл необходимо. Промойте SSM с неправительственными организациями, активизирующий раствор. Разморозить образец белка на льду. Три 10-секундный цикл обработки ультразвуком чередуются с 10 с интервалом охлаждения на льду. Протеолипосомы обрабатывают ультразвуком использованием ультразвуковой ванны. Для фрагментов мембран ультразвукового наконечника (50 Вт, 30 кГц, 1 мм диаметр волновода, интенсивность 20%, 0,5 цикла) используется. После последней стадии обработки ультразвуком не ставят образца вернуться на лед, но внедрить его непосредственно в кювете. Открутите выпускной патрубок вместе с электродом сравнения ассmbly. С помощью пипетки, аспирация 30 мкл образца белка и смонтировать пипетки с выходным отверстием. Откройте ручной клапан в не-активирующие пути в контейнер для отходов и ввести протеолипосомами в объем кюветы. Будьте осторожны, чтобы не вдохнуть воздух в объеме кюветы с датчиком. Перед снятием кончиком пипетки, закройте ручной клапан, чтобы предотвратить дальнейшее потока раствора. Разрешить протеолипосом адсорбировать на ССМ для инкубации в течение от 1 до 2 часов. Кроме того, можно инкубировать в течение ночи. 3.6 Общий порядок SSM основе эксперимента Разминка измерения буферов во времени, при хранении при 4 ° С. Все измерительные буферы должны быть комнатной температуры перед началом измерения, чтобы избежать артефактов. При изменении решения очисти прежде внутренность труб решение контейнеры с не-фаззинг ткани, а затем вставьте новые бутылки. Перед тем как начать измерение, с помощью ручных клапанов для удаления пузырьков воздуха, которые могли развиться в результате изменения процедуры. Отрегулируйте давление непосредственно перед началом измерений. Мы обычно используют давление от 0,6 бар, который в нашем конкретном клапан и трубка конфигурация дает скорость потока приблизительно 1,0 мл / сек. Первые несколько измерений может быть осуществлен прямой один за другим и должна быть отклонена до пикового тока остается постоянной. Если решения отличаются рН инкубации в течение по крайней мере 3 мин необходимо регулировать внутреннюю рН протеолипосом перед началом измерения. Сейчас создана готов к измерениям. Чтобы уменьшить шум, по крайней мере, три измерения должны быть сделаны и усреднены. 3,7 контрольных измерений Ранг сигнала во время серии измерений могут произойти из-за деградации белков или потеря адсорбции. Каждый SSM эксперимента я долженNCLUDE Ранг управления. Это делается путем многократных измерений с одинаковым решениям. Минимальный контроль изложение означает одно измерение в начале и один в конце эксперимента, используя те же решения. Мы рекомендуем делать Ранг управления в условиях, когда вы ожидаете высокий пик амплитуды в эксперименте. Это облегчает для количественной оценки изложение сигнала. Сигнал изложение может быть определена количественно путем сравнения амплитуды пиков двух элементов управления изложение. Полученное процентное значение может быть использована для коррекции измеряемых сигналов в предположении линейной зависимости время сокращения. 3.8 контроль Артефакт Если возможно, попытайтесь для проверки результатов путем ингибирования белка, представляющего интерес после эксперимента. Остальные сигналы, вероятно, артефакты решение обмена. Затем сигналы должны быть исправлены для измеренной артефактов. <p cдевушка = "jove_step"> 3.9 После эксперимента Промыть системы с 20-30 мл чистой воды и 20-30 мл 30% этанола / воды. Этанольный раствор предотвращает рост бактерий, когда система не используется. После этой процедуры очистки, сброса давления из системы и выключите все инструменты. Удалите кювету из клетки Фарадея и отключить его. Все части кюветы может быть очищено с водой и чистого этанола, при необходимости, с использованием ультразвуковой ванны. Поместите датчик чип в стеклянной стакан с чистого этанола. Обрабатывают ультразвуком химическом стакане в течение от около 1 до 2 мин с использованием ультразвуковой ванны. Сушат сенсорный чип в атмосфере азота. Храните сенсорный чип вдали от света в 10 мМ Octadecanthiol решение этаноле. После инкубации в течение 30 мин микросхемы датчика готов к повторному использованию.