Introduzione alla membrana supportata Solid Sulla Elettrofisiologia

1. Impostazione di un apparato per SSM-based Elettrofisiologia I dettagli sono forniti in due delle nostre pubblicazioni tecniche, che contengono anche disegni schematici e le fotografie dei nostri cuvette e impostare 1, 2. Diverse configurazioni di scambio di soluzioni e protocolli di flusso sono discussi anche nel nostro documento metodo 2. Nel seguito si aggiungono alcuni miglioramenti recenti e dettagli tecnici che sono di diretta rilevanza per il video di presentazione. Controllo della valvola e l'acquisizione dei dati La scatola contiene una interfaccia di uscita / interfaccia USB commerciale digitale di ingresso analogico (NI 6009 NI USB) e dei driver delle valvole. Esso controlla il flusso della soluzione ed è responsabile per l'acquisizione dati. Le valvole sono normalmente guidati con 12 V. Tuttavia, per una rapida commutazione delle valvole possono essere guidati con una tensione massima di 18 V. Nel video si usa un alimentatore a 12 V. </P> Il circuito driver di valvola può operare quattro valvole. E 'stato prodotto dalla bottega del Max Planck Institute di Biofisica. Le valvole possono essere controllati da computer o manualmente tramite switch sul pannello frontale. Quest'ultimo è utile per la pulizia-procedure-e vampate di calore. Durante la misura, la scatola di interfaccia è controllato dal computer utilizzando una valvola di controllo e software di acquisizione dati (Surfe 2 software R, IonGate Biosciences). 2. Preparativi In questa sezione sono indicati i diversi protocolli per la preparazione di un esperimento di elettrofisiologia SSM-based. 2.1 Rendere la soluzione di lipidi per la formazione del SSM Miscelare 25 pl octadecilammina (5 mg / ml di cloroformio) e 375 Diphytanoylphosphatidylcholine microlitri (20 mg / ml di cloroformio) in una fiala glas. Utilizzando un evaporatore rotante e il flusso continuo di gas azoto, si evapora il cloroformio percirca 30 min. Rimuovere il lipide dalle pareti della fiala di vetro agitando con 500 ml di n-decano. La concentrazione di lipidi finale è di 15 mg / ml con 1:60 (w / w) octadecilammina. Trasferire la soluzione nella fiala di vetro di stoccaggio. Conservare la soluzione lipidica a -20 ° C. 2.2 clorazione dell'elettrodo di riferimento Gli elettrodi di riferimento devono essere clorurato ad intervalli regolari per abrasione. Togliere il resto del vecchio strato silverchloride utilizzando carta abrasiva fine prima che il processo di clorazione. Posizionare il filo d'argento con un elettrodo di platino in una soluzione M di acido cloridrico 1 e cloro per 15 min a 0,5 mA. Dopo aver completato clorazione, il filo di argento cambia colore ad un grigio scuro omogeneo. 2.3 Preparazione del ponte gel di poliacrilammide Preparare una soluzione contenente 100 mM KPI a pH = 7, 100 mM KCl e 6% Acrilammide. Aggiungere 0,3% APS (10% Archivio) e 0,6% TEMED e poco miscelare la soluzione con una pipetta. Immediatamente dopo la miscelazione della soluzione, utilizzare una pipetta per iniettare 30 microlitri della miscela nel contenitore vuoto ponte gel. È importante evitare bolle d'aria durante l'iniezione. Durante un tempo di incubazione di 20 min gel polimerizza. Dopo la polimerizzazione il ponte gel è memorizzato in soluzione (100 mM pH 7 KPI, 100 mM KCl). Per prolungare la durata di vita del ponte gel la soluzione viene conservata a 4 ° C. 2.4 Preparazione delle soluzioni di misura A causa della forte interazione dei soluti con il SSM, artefatti elettrici sono generati quando le soluzioni di diversa composizione vengono scambiati. Pertanto, la preparazione delle soluzioni è un passaggio fondamentale. Adottare le seguenti precauzioni durante il processo di preparazione della soluzione per ridurre al minimo gli artefatti di scambio di soluzione. Make non attivando e attivando soluzioni da un lotto, regolare il pH e forza ionica. Sfondo di sale aiuta a ridurre i tassi di artefatti soluzione. Dividere la soluzione lotto in due volumi. Aggiungere il composto attivante alla soluzione attivante. Usare un preparato compensativo nella soluzione non-attivante per mantenere l'osmolarità e forza ionica di entrambe le soluzioni il più possibile simili. Se le soluzioni sono conservati a 4 ° C, assicurarsi che tutte le soluzioni hanno raggiunto la temperatura ambiente prima di iniziare una misurazione, perché anche piccole differenze di temperatura possono produrre artefatti. 3. Un esperimento Elettrofisiologia SSM-based Qui vi presentiamo un protocollo tipico per un esperimento elettrofisiologico SSM-based. 3.1 Preparazione del Setup SSM Mentre l'installazione SSM non è in uso, i tubi sono riempiti con un etanolo al 30%Soluzione / acqua per evitare la crescita batterica. Lavare il sistema con acqua pura per eliminare l'etanolo dal tubo prima di montare la cuvetta. Sostituire i contenitori etanolo con contenitori per l'acqua. Utilizzando ad alta pressione (da 0,6 a 1,0 bar) pulire il sistema con 20-30 ml di acqua. Ripetere la procedura di pulizia utilizzando un buffer di 100 mM KPI a pH 7.6 o soluzione non attivante. Assicurarsi che non rimangano bolle d'aria nel sistema fluido. 3.2 Montaggio della cuvetta Fissare un o-ring per l'elettrodo di riferimento Prendete il ponte di gel dalla soluzione di storage e collegare l'elettrodo di riferimento. Prefill il raccordo di uscita con tampone non-attivante, inserire un o-ring e collegare il ponte gel per completare il gruppo elettrodo di riferimento. Faccia particolare attenzione che non vi siano bolle d'aria al bivio del ponte di gel e la presa di soluzione flusso percorso. Preassemblare la parte principale della cuvette aggiungendo il perno di contatto a molla (collegamento all'amplificatore), il tubo di ingresso (collegamento alla valvola terminale), l'anello di tenuta (tenuta per la SSM) e le viti. Utilizzando una pinzetta, prendere il chip del sensore dalla soluzione di memorizzazione (10 mM OCTADECANETIOLO in etanolo). Usando una pipetta, lavare la soluzione rimanente con ca. 5 ml di etanolo puro. Asciugare l'elettrodo sotto azoto. Posizionare il chip del sensore con precisione sulla parte di base della cuvetta in modo che il foro di ingresso della parte principale della cuvetta è diretto verso l'area attiva del sensore circolare. Aggiungere 1 ml della soluzione lipidica all'area attiva del chip sensore. Accertarsi che lo strato di oro è interamente coperto dalla lipidico. Immediatamente dopo l'aggiunta della soluzione lipidica, chiudere la cuvetta aggiungendo la parte principale preassemblato. Prima di montare la cuvetta nella gabbia di Faraday, assicurarsi che tutte le superfici siano completamente asciutti. Connect dell'amplificatore al pin di contatto a molla e il tubo di ingresso alla valvola terminale. Quindi fissare la provetta con le viti all'interno della gabbia di Faraday. Avvitare il raccordo di uscita all'inizio della cuvetta. Infine collegare il tubo di uscita per il raccordo di uscita ed il generatore di tensione all'elettrodo di riferimento. Immediatamente dopo il montaggio della cuvetta lavare il sistema con tampone a 0,6 bar. Ciò porta alla formazione spontanea SSM. 3.3 Parametri di membrana di misura Per verificare la qualità della SSM, capacità e conduttanza sono misurate utilizzando il generatore di funzioni. Utilizzando il generatore di funzioni, applicare 100 mV tensione in CC per misurare la conduttanza. Calcolare la conduttanza: Il decadimento attuale dimostra la carica del condensatore membrana. Dopo il condensatore è completamente carica i rendimenti attuali misurati la conduttanza della membrana utilizzando la legge di Ohm. Per ragioni di semplicità usiamo la current 1 sec dopo che la tensione è applicata per calcolare la conduttanza G = I / U. Applicare una tensione alternata triangolare di 50 mV picco a picco ampiezza e la frequenza di 0,5 Hz per misurare la capacitanza. Calcolare la capacità: L'ampiezza della corrente risultante onda quadra rappresenta le correnti di carica del condensatore. La capacità C è uguale alla carica trasferita Q = IΔt diviso ΔU = 100 mV. (ΔU è due volte la tensione applicata di 50 mV perché I è la corrente differenza di pendenza positiva minus negativo della tensione triangolare.) Monitorare i parametri elettrici della membrana ripetutamente ogni 10 min per ca. 30 e 40 minuti, fino a raggiungere valori costanti. Lavare con tampone tra Kpi ad alta pressione nell'intervallo da circa 0,6 a 1 bar. Stimare la qualità del SSM: Parametri ottimali sono nell'intervallo da 0,1 a 0,2 ns e 2-3,5 nF. Un alto conduttanza sopra 0,8 nS e bassa capacità al di sotto di 1 nF indicache la SSM non si forma correttamente. Un alto capacitanza 4 nF sopra può comportare che la zona attiva non è coperto completamente dal SSM. Se i parametri non sono nel range ottimale, la membrana deve essere scartata ed un'altra SSM preparato, utilizzando un chip appena preparato elettrodo. 3.4 Controllo di scambio artefatti soluzione Dopo che i parametri di membrana sono stati controllati, i buffer di misura dovrebbero essere testati per i tassi di artefatti soluzione. Inserire i rispettivi contenitori soluzione del sistema fluido. Rimuovere le bolle d'aria dal sistema fluido, utilizzando le valvole manuali. Utilizzando il software di acquisizione dati ha scelto il protocollo di flusso che si desidera utilizzare nel vostro esperimento. Regolare la pressione a 0,6 bar e avviare la misurazione. A parte gli artefatti di commutazione delle valvole meccaniche, idealmente non correnti artefatti dovrebbero essere misurati o dovrebbero essere molto smaller che i segnali della proteina di trasporto previsti. Se si osservano tassi di artefatti soluzione, cercare di ottimizzare le composizioni di buffer e / o la procedura di preparazione prima di continuare l'esperimento. 3.5 Aggiunta del campione di proteine Di solito proteoliposomi o frammenti di membrana sono conservati congelati a -80 ° C. Per una misurazione è necessaria una aliquota di circa 30 microlitri. Sciacquare la SSM con soluzione non attivante. Scongelare il campione di proteine ​​in ghiaccio. Tre cicli di sonicazione di 10 secondi si alternano a intervalli di 10 secondi di raffreddamento sul ghiaccio. Proteoliposomi sono sonicati utilizzando un bagno di sonicazione. Per i frammenti di membrana è usato un sonicatore punta (50W, 30 kHz, 1 mm di diametro sonotrode, intensità 20%, ciclo di 0,5). Dopo l'ultimo passo sonicazione non mettere il campione torna sul ghiaccio, ma iniettare immediatamente nella cuvetta. Svitare il connettore della presa insieme al elettrodo di riferimento asseMBLY. Usando una pipetta, aspirare 30 ml del campione di proteine ​​e montare la punta della pipetta alla presa di annoiarvi. Aprire la valvola manuale nella via non-attivante al contenitore dei rifiuti e iniettare i liposomi nel volume della cuvetta. Fare attenzione a non iniettare aria nel volume della cuvetta con il sensore. Prima di rimuovere la punta della pipetta, chiudere la valvola manuale per evitare l'ulteriore flusso di soluzione. Lasciare le proteoliposomi di adsorbimento al SSM per un tempo di incubazione di 1-2 ore. È anche possibile incubare durante la notte. 3.6 Procedura generale di un esperimento SSM-based Scaldare i buffer di misura nel tempo, se conservato a 4 ° C. Tutti i tamponi di misura devono essere a temperatura ambiente prima di iniziare la misurazione per evitare artefatti. Quando si cambiano le soluzioni, prima pulire i tubi all'interno dei contenitori di soluzione con un tessuto non-fuzzing, quindi inserire le nuove bottiglie. Prima di avviare la misurazione, utilizzare le valvole manuali per rimuovere le bolle d'aria, che potrebbero sono evoluti dalla procedura di modifica. Regolare la pressione poco prima di iniziare una misurazione. Noi abitualmente uso una pressione di 0,6 bar, che a nostra valvola e tubo specifica configurazione produce una velocità di flusso di 1,0 ml / sec. Le prime misurazioni possono essere effettuate direttamente uno dopo l'altro e dovrebbero essere rifiutati fino alla corrente di picco rimane costante. Se le soluzioni differiscono pH un tempo di incubazione per almeno 3 minuti è necessario per regolare il pH interno delle proteoliposomi prima della misurazione. Ora il set up è pronto per la misura. Per ridurre il rumore di almeno 3 misurazioni devono essere effettuate e media. 3.7 Misure di controllo Una carrellata segnale durante una serie di misurazioni potrebbe verificarsi a causa di degradazione della proteina o una perdita di adsorbimento. Ogni esperimento deve SSM iNCLUDE un controllo fatiscente. Questo è fatto da misurazioni ripetute con soluzioni identiche. Il controllo avvitatura minima significa una misurazione all'inizio e uno alla fine dell'esperimento, utilizzando la stessa soluzione. Si consiglia di fare il controllo della riduzione di attività in condizioni in cui ci si aspetta la massima ampiezza di picco nell'esperimento. Questo rende più facile quantificare la riduzione di attività del segnale. La carrellata di segnale può essere quantificata da un confronto tra le ampiezze di picco dei due controlli fatiscenti. Il valore percentuale risultante può essere utilizzato per correggere i segnali misurati ipotizzando un tempo di dipendenza lineare della avvitatura. 3.8 Controlli Artefatto Se possibile, cercare di convalidare i risultati per inibire la proteina di interesse dopo l'esperimento. Segnali rimanenti sono probabilmente tassi artefatti soluzione. I segnali devono poi essere corretti per i manufatti misurati. <p class = "jove_step"> 3.9 Dopo l'esperimento Lavare il sistema con 20-30 ml di acqua pura e 20-30 ml di 30% di etanolo / acqua. La soluzione etanolica evita la crescita batterica quando il sistema non è in uso. Dopo questa procedura di pulizia, togliere la pressione dal sistema e spegnere tutti gli strumenti. Rimuovere la cuvetta dalla gabbia di Faraday e toglierla. Tutte le parti della cuvetta possono essere pulite con acqua ed etanolo puro, se necessario, utilizzando un bagno sonicatore. Posizionare il chip del sensore in un bicchiere di vetro con etanolo puro. Sonicazione il becher per circa 1 a 2 minuti usando un bagno sonicatore. Asciugare il chip del sensore sotto azoto. Memorizzare il chip sensore lontano dalla luce in una soluzione etanolica Octadecanthiol 10 mM. Dopo un tempo di incubazione di circa 30 min chip del sensore è pronto per il riutilizzo.