ממברנות המיטוכונדריה הקשורים ER (MAMs) וMicrodomains Glycosphingolipid המועשר (אובניים חן): בידוד ממוח עכבר
Summary
הליך זה מדגים כיצד לבודד מהמוח המבוגר עכבר קרומי המיטוכונדריה או MAMs הקשורים ER וmicrodomain המועשרים glycosphingolipid השברים מMAMs ותכשירי המיטוכונדריה.
Abstract
האברונים תאיים הם מבנים דינמיים מאוד עם צורות שונות ובהרכב, שכפופים לרמזים פנימיים וחיצוניים של תאים ספציפיים. הקרומים שלהם לעתים קרובות באתרי juxtaposed מגע מוגדר, אשר הופכים לרכזות חילופי מולקולות איתות ורכיבי קרום 1,2,3,4. את microdomains הקרום בין organellar שנוצרו בין reticulum endoplasmic (ER) ואת המיטוכונדריה בפתיחת Ca IP3 הרגיש 2 + ערוץ ידוע כמו קרומים קשורים-ER מיטוכונדריה או MAMs 4,5,6. רכב חלבונים / שומנים והתכונות הביוכימיות של אתרי מגע קרום אלה נחקרו רבים בעיקר בהקשר לתפקידם בוויסות התאי Ca 2 + 4,5,6. ER משמש כחנות העיקרית של Ca 2 + התאי, ובמסגרת זו מווסתת מספר עצום של תהליכים תאיים במורד זרם של Ca 2 + איתות, כוללuding מתקפל וחלבון maturation7 חלבון שלאחר translational. המיטוכונדריה, לעומת זאת, לשמור על Ca 2 + הומאוסטזיס, על ידי אגירת cytosolic Ca 2 + ריכוז ובכך למנוע את החניכה של מסלולים אפופטוטיים במורד הזרם של Ca 2 + איזון 4,8. האופי הדינמי של MAMs הופך אותם אידיאליים אתרים לנתח מנגנונים תאיים בסיסיים, כולל Ca 2 + איתות ובקרה של המיטוכונדריה Ca 2 + ריכוז, ביוסינתזה שומנים ותחבורה, חילוף חומרים של אנרגיה ותא הישרדות 4,9,10,11,12. כמה פרוטוקולים שתארו לטיהור microdomains אלה מרקמת כבד ותאים בתרבית 13,14.
לוקח שיטות שפורסמו בעבר בחשבון, יש לנו מותאם פרוטוקול לבידוד של המיטוכונדריה וMAMs ממוח העכבר הבוגר. להליך זה יש לנו הוספתי שלב נוסף טיהור, כלומר מיצוי x100 טריטון, שדוארnables הבידוד של שבריר glycosphingolipid המועשר microdomain (GEM) של MAMs. הכנות GEM אלה חולקים מספר מרכיבי חלבון עם רפסודות caveolae ושומנים בדם, הנגזרות מקרום הפלזמה או קרומים תאיים אחרים, והציעו לשמש איסוף נקודות עבור האשכולות של חלבוני הקולטן ולאינטראקציות בין חלבונים 4,15.
Protocol
Representative Results
Discussion
האתרים של מגע בין קרומים תאיים או בין האברונים וקרום הפלזמה של תאים מייצגים פלטפורמות איתות דינמיות לתהליכים תאיים בסיסיים. האפיון המדויק של התפקוד ובהרכב שלהם תחת שני תנאים פיסיולוגיים ופתולוגיים דורש פרוטוקולי טיהור אמינות ושחזור. השיטות, כמפורט כאן כבר מותאמות ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מכירים בתרומה של הרנטה סנו בהריון הפרוטוקול הראשוני. Ad'A. מחזיק את התכשיטים לילדים (JFC) ניחן קתדרה לגנטיקה וריפוי גנטי. עבודה זו מומנה בחלקו על ידי מענקי NIH GM60905, DK52025 וCA021764, ואת הצדקה האמריקנית הלבנונית הסורית, המזוהית (ALSAC).
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalogue Number | Comments |
| REAGENTS | |||
| Fractionation | |||
| Sucrose | Fisher Scientific | S5-500 | |
| Sodium Bicarbonate | Sigma-Aldrich | S-5761 | |
| Magnesium Chloride, Hexahydrate | Fisher Scientific | BP214-500 | |
| Calcium Chloride, Dihydrate | Sigma-Aldrich | C-5080 | |
| MAM | |||
| D-Mannitol | Sigma-Aldrich | M9546-250G | |
| Hepes | Fisher Scientific | BP310-500 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E4378-250G | |
| BSA, Fraction V, Heat Shock, Lyophilizate | Roche | 03-116-964-001 | |
| Percoll | GE | 17-0891-02 | |
| GEM | |||
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T9284-500 ml | |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | S271-3 | |
| Tris Base | Roche | 03-118-142-001 | |
| HCl | Fisher Scientific | A144S-500 | |
| EDTA | Fisher Scientific | BP120-500 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | Fisher Scientific | BP166-500 | |
| Common | |||
| Protease Inhibitors Tablets, Complete EDTA-free | Roche | 11-873-580-001 | |
| EQUIPMENT | |||
| 2 ml Douce All-Glass Tissue Grinders | Kimble Chase | 885300-0002 | |
| 15 ml Polypropylene Conical Centrifuge Tubes, BD Falcon | BD | 352097 | |
| 30 ml Round-Bottom Glass Centrifuge Tubes | Kimble Chase | 45500-30 | |
| 15 ml Round-Bottom Glass Centrifuge Tubes | Kimble Chase | 45500-15 | |
| Ultracentrifuge tubes, Ultra-Clear, Thinwall, 14×89 mm | Beckman-Coulter | 344059 | |
| Parafilm | Cole-Parmer | PM996 | |
| Disposable Borosilicate Glass Pasteur Pipets, 9″ | Fisher Scientific | 13-678-20C |
References
- Poburko, D., Kuo, K. H., Dai, J., Lee, C. H., van Breemen, C. Organellar junctions promote targeted Ca2+ signaling in smooth muscle: why two membranes are better than one. Trends Pharmacol. Sci. 25 (1), 8-15 (2004).
- Pani, B., Ong, H. L., Liu, X., Rauser, K., Ambudkar, I. S., Singh, B. B. Lipid rafts determine clustering of STIM1 in endoplasmic reticulum-plasma membrane junctions and regulation of store-operated Ca2+ entry (SOCE. J. Biol. Chem. 283 (25), 17333-17340 (2008).
- Levine, T., Rabouille, C. Endoplasmic reticulum: one continuous network compartmentalized by extrinsic cues. Curr. Opin. Cell Biol. 17 (4), 362-368 (2005).
- Sano, R., Annunziata, I., Patterson, A., Moshiach, S., Gomero, E., Opferman, J., Forte, M., d’Azzo, A. GM1-ganglioside accumulation at the mitochondria-associated ER membranes links ER stress to Ca(2+)-dependent mitochondrial apoptosis. Mol. Cell. 36 (3), 500-511 (2009).
- Raturi, A., Simmen, T. Where the endoplasmic reticulum and the mitochondrion tie the knot: The mitochondria-associated membrane (MAM). Biochim. Biophys. Acta. , (2012).
- Giorgi, C., De Stefani, D., Bononi, A., Rizzuto, R., Pinton, P. Structural and functional link between the mitochondrial network and the endoplasmic reticulum. Int. J. Biochem. Cell Biol. 41 (10), 1817-1827 (2009).
- d’Azzo, A., Tessitore, R. Sano Gangliosides as apoptotic signals in ER stress response. Cell Death Differ. 13, 404-414 (2006).
- Kroemer, G., Galluzzi, L., Brenner, C. Mitochondrial membrane permeabilization in cell death. Physiol. Rev. 87, 99-163 (2007).
- Rizzuto, R., Brini, M., Murgia, M., Pozzan, T. Microdomains with high Ca2+ close to IP3-sensitive channels that are sensed by neighboring mitochondria. Science. 262, 744-747 (1993).
- Lynes, E. M., Bui, M., Yap, M. C., Benson, M. D., Schneider, B., Ellgaard, L., Berthiaume, L. G., Simmen, T. Palmitoylated TMX and calnexin target to the mitochondria-associated membrane. EMBO J. 31 (2), 457-470 (2011).
- Fujimoto, M., Hayashi, T., Su, T. P. The role of cholesterol in the association of endoplasmic reticulum membranes with mitochondria. Biochem. Biophys. Res. Commun. 417 (1), 635-639 (2012).
- Grimm, S. The ER-mitochondria interface: the social network of cell death. Biochim. Biophys. Acta. 1823 (2), 327-334 (2012).
- Vance, J. E. Phospholipid synthesis in a membrane fraction associated with mitochondria. J. Biol. Chem. 265, 7248-7256 (1990).
- Wieckowski, M. R., Giorgi, C., Lebiedzinska, M., Duszynski, J., Pinton, P. Isolation of mitochondria-associated membranes and mitochondria from animal tissues and cells. Nat. Protoc. 4 (11), 1582-1590 (2009).
- Pizzo, P., Viola, A. Lymphocyte lipid rafts: structure and function. Curr. Opin. Immunol. 15 (3), 255-260 (2003).
