Extracellulair Het identificeren van Motor Neuronen voor een Muscle Motor Pool in<em> Aplysia californica</em
Summary
In dieren met grote geïdentificeerde neuronen (<em> Bv</em> Weekdieren), wordt de analyse van de motorische zwembaden gedaan met behulp van intracellulaire technieken<sup> 1,2,3,4</sup>. Onlangs hebben we een techniek ontwikkeld om extracellulair stimuleren en individuele neuronen opnemen in<em> Aplysia californica</em<sup> 5</sup>. We hebben nu beschrijven een-protocol voor het gebruik van deze techniek om eenduidig te identificeren en motorische neuronen karakteriseren binnen een motor zwembad.
Abstract
Bij dieren met grote geïdentificeerde neuronen (bijv. weekdieren), analyse van de motor pools wordt gedaan met behulp van intracellulaire technieken 1,2,3,4. Onlangs, ontwikkelden we een techniek om extracellulair te stimuleren en op te nemen individuele neuronen in Aplysia californica 5. We hebben nu beschrijven een-protocol voor het gebruik van deze techniek om eenduidig te identificeren en motorische neuronen karakteriseren binnen een motor zwembad.
Deze extracellulaire techniek heeft voordelen. Elke optie, extracellulaire elektroden kan stimuleren en neuronen opnemen door de schede 5, zodat het hoeft niet worden verwijderd. Aldus zullen neuronen gezonder zijn in extracellulaire experimenten dan in intracellulaire degenen. Ten tweede, als ganglia zijn geroteerd door passende pinning van de mantel, kan extracellulaire elektroden toegang neuronen aan beide zijden van de ganglion, waardoor het eenvoudiger en efficiënter te identificeren meerdere neuronen in hetzelfde preparaat. Third, extracellular elektroden hoeven niet te cellen te penetreren, en dus gemakkelijk kunnen worden heen en weer liep tussen neuronen, waardoor minder schade berokkenen. Dit is vooral handig wanneer men probeert om meerdere neuronen op te nemen in de loop van te herhalen motor patronen dat alleen kan aanhouden voor minuten. Vierde, extracellulaire elektroden soepeler zijn dan intracellular Wat is tijdens spierbewegingen. Intracellulaire elektroden kunnen eruit trekken en deze beschadigen neuronen tijdens spiercontracties. In contrast, aangezien extracellulaire elektroden worden voorzichtig geperst op de schede bovenstaande neuronen, ze verblijven meestal boven hetzelfde neuron tijdens spiercontracties, en kan dus worden gebruikt in more intact preparaten.
Als unieke motor neuronen identificeren voor een motor pool (in name, de I1/I3 spier in Aplysia) met behulp extracellulaire elektroden, kan men gebruik features die niet vereisen intracellulaire metingen als criteria: soma size and location, axonale projectie, en spier innervatie 4, 6,7. Voor de specifieke motor pool gebruikt om de techniek illustreren, we opgenomen vanuit buccale zenuwen 2 en 3 om axonale projecties meten, en gemeten de samentrekking krachten van de I1/I3 spier om het patroon van spier innervatie voor de afzonderlijke motor neuronen bepalen.
We aan te tonen het complete proces van de eerste het identificeren van motorische neuronen met behulp van spier innervatie, dan is het karakteriseren van hun timing tijdens de motorische patronen, het creëren van van een vereenvoudigde diagnostische methode voor de snelle identificatie. De vereenvoudigde en nog veel meer snelle diagnostische methode is superieur voor meer intacte de voorbereidingen, bijv. in de geschorste buccale massa-het preparaat 8 of in vivo 9. Deze taak kan ook worden toegepast in andere motor pools 10,11,12 in Aplysia of in andere dierlijke systemen 2,3,13,14.
Protocol
Representative Results
Discussion
In dieren met grote geïdentificeerde neuronen, zoals weekdieren (bijvoorbeeld Lymnaea, Helix, en Aplysia), analyse van motor pools wordt meestal gedaan met behulp intracellulaire opname 1,2,3,4. In dit protocol, beschrijven we een werkwijze voor uniek identificeren de motor neuronen voor een motor pool behulp een extracellulair techniek. We de krachtmetingen gebruikt als illustratie van dit proces. Men zou ook kunnen gebruik maken van EMG om spier te innervaties te meten. Kort, daartoe, de …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit onderzoek werd ondersteund door NIH subsidie NS047073 en NSF subsidie DMS1010434.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium chloride | Fisher Scientific | S671 | Biological, Certified |
| Potassium chloride | Fisher Scientific | P217 | Certified ACS |
| Magnesium chloride hexahydrate | Acros Organics | 19753 | 99% |
| Magnesium sulfate heptahydrate | Fisher Scientific | M63 | Certified ACS |
| Calcium chloride dihydrate | Fisher Scientifc | C79 | Certified ACS |
| Glucose (dextrose) | Sigma-Aldrich | G7528 | BioXtra |
| MOPS buffer | Acros Organics | 17263 | 99% |
| Carbachol | Acros Organics | 10824 | 99% |
| Sodium hydroxide | Fisher Scientific | SS255 | Certified |
| Hydrochloric acid | Fisher Scientific | SA49 | Certified |
| Single-barreled capillary glass | A-M Systems | 6150 | |
| Flaming-Brown micropipette puller model P-80/PC | Sutter Instruments | Filament used: FT345B | |
| Enamel coated stainless steel wire | California Fine Wire | 0.001D, coating h | |
| Household Silicone II Glue | GE | ||
| Duro Quick-Gel superglue | Henkel corp. | ||
| A-M Systems model 1700 amplifier | A-M Systems | Filter settings: 10-500 Hz for the I2 nerve/muscle; 300-500 Hz for all the other nerves | |
| Pulsemaster Multi-Channel Stimulator | World Precision Instruments | A300 | |
| Stimulus Isolator | World Precision Instruments | A360 | |
| AxoGraph X | AxoGraph Scientific | Software for recordings | |
| Gold Connector Pins | Bulgin | SA3148/1 | |
| Gold Connector Sockets | Bulgin | SA3149/1 | |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer | Dow Corning | ||
| 100 x 15 mm Crystalizing Dish | Pyrex | ||
| High Vacuum Grease | Dow Corning | ||
| Pipet Tips | Fisher Scientific | 21-375D | |
| Minutien Pins | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| Modeling Clay | Sargent Art | 22-4400 | |
| Whisper Air Pump | Tetra | 77849 | |
| Aquarium Tubing | Eheim | 7783 | 12/16 mm |
| Elite Airstone | Hagen | A962 | |
| Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15000-08 | |
| Dumont #5 Fine Forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| Kimwipes | Kimberly-Clark | 34155 |
References
- McCrohan, C. R., Benjamin, P. R. Synaptic relationships of the cerebral giant cells with motoneurones in the feeding system of Lymnaea stagnalis. J. Exp. Biol. 85, 169-186 (1980).
- Benjamin, P. R., Rose, R. M. Central generation of bursting in the feeding system of the snail, Lymnaea stagnalis. J. Exp. Biol. 80, 93-118 (1979).
- Peters, M., Altrup, U. Motor organization in pharynx of Helix pomatia. J. Neurophysiol. 52 (3), 389-409 (1984).
- Church, P. J., Cohen, K. P., Scott, M. L., Kirk, M. D. Peptidergic motoneurons in the buccal ganglia of Aplysia californica: immunocytochemical, morphological, and physiological characterizations. J. Comp. Physiol. A. 168 (3), 323-336 (1991).
- Lu, H., Chestek, C. A., Shaw, K. M., Chiel, H. J. Selective extracellular stimulation of individual neurons in ganglia. J. Neural. Eng. 5 (3), 287-309 (2008).
- Church, P. J., Lloyd, P. E. Expression of diverse neuropeptide cotransmitters by identified motor neurons in Aplysia. J. Neurosci. 11 (3), 618-625 (1991).
- Church, P. J., Lloyd, P. E. Activity of multiple identified motor neurons recorded intracellularly during evoked feedinglike motor programs in Aplysia. J. Neurophys. 72 (4), 1794-1809 (1994).
- McManus, J. M., Lu, H., Chiel, H. J. An In Vitro Preparation for Eliciting and Recording Feeding Motor Programs with Physiological Movements in Aplysia californica. J. Vis. Exp. (70), e4320 (2012).
- Cullins, M. J., Chiel, H. J. Electrode fabrication and implantation in Aplysia californica for multi-channel neural and muscular recordings in intact, freely behaving animals. J Vis. Exp. (40), e1791 (2010).
- Zhurov, Y., Weiss, K. R., Brezina, V. Tight or loose coupling between components of the feeding neuromusculature of Aplysia. J. Neurophysiol. 94 (1), 531-549 (2005).
- Hurwitz, I., Goldstein, R. S., Susswein, A. J. Compartmentalization of pattern-initiation and motor functions in the B31 and B32 neurons of the buccal ganglia of Aplysia californica. J. Neurophysiol. 71 (4), 1514-1527 (1994).
- Morton, D. W., Chiel, H. J. The timing of activity in motor neurons that produce radula movements distinguishes ingestion from rejection in Aplysia. J. Comp. Physiol. A. 173 (5), 519-536 (1993).
- Iles, J. F. Structure and synaptic activation of the fast coxal depressor motoneurone of the cockroach. Periplaneta americana. J. Exp. Biol. 56 (3), 647-656 (1972).
- Westerfield, M., McMurray, J. V., Eisen, J. S. Identified motoneurons and their innervation of axial muscles in the zebrafish. J. Neurosci. 6 (8), 2267-2277 (1986).
- Susswein, A. J., Rosen, S. C., Gapon, S., Kupfermann, I. Characterization of buccal motor programs elicited by a cholinergic agonist applied to the cerebral ganglion of Aplysia californica. J. Comp. Physiol. A. 179 (4), 509-524 (1996).
- Hurwitz, I., Neustadter, D., Morton, D. W., Chiel, H. J., Susswein, A. J. Activity patterns of the B31/B32 pattern initiators innervating the I2 muscle of the buccal mass during normal feeding movements in Aplysia californica. J. Neurophys. 75 (4), 1309-1326 (1996).
- Morton, D. W., Chiel, H. J. In vivo buccal nerve activity that distinguishes ingestion from rejection can be used to predict behavioral transitions in Aplysia. J. Comp. Physiol. A. 172 (1), 17-32 (1993).
- Warman, E. N., Chiel, H. J. A new technique for chronic single-unit extracellular recording in freely behaving animals using pipette electrodes. J. Neurosci. Methods. 57 (2), 161-169 (1995).
- Nargeot, R. N., Baxter, D. A., Byrne, J. H. Contingent-dependent enhancement of rhythmic motor patterns: an in vitro analog of operant conditioning. J. Neurosci. 17 (21), 8093-8105 (1997).
- Kandel, E. R. . Behavioral biology of Aplysia. , (1979).
- Scott, M. L., Govind, C. K., Kirk, M. D. Neuromuscular organization of the buccal system in Aplysia californica. J. Comp. Neurol. 312 (2), 207-222 (1991).
- Rosen, S. C., Miller, M. W., Cropper, E. C., Kupfermann, I. Outputs of radula mechanoafferent neurons in Aplysia are modulated by motor neurons, interneurons, and sensory neurons. J. Neurophysiol. 83 (3), 1621-1636 (2000).
- Rosen, S. C., Miller, M. W., Evans, C. G., Cropper, E. C., Kupfermann, I. Diverse synaptic connections between peptidergic radula mechanoafferent neurons and neurons in the feeding system of Aplysia. J. Neurophysiol. 83 (3), 1605-1620 (2000).
- Weiss, K. R., Chiel, H. J., Koch, U., Kupfermann, I. Activity of an identified histaminergic neuron, and its possible role in arousal of feeding behavior in semi-intact Aplysia. J. Neurosci. 6 (8), 2403-2415 (1986).
- Rosen, S. C., Teyke, T., Miller, M. W., Weiss, K. R., Kupfermann, I. Identification and characterization of cerebral-to-buccal interneurons implicated in the control of motor programs associated with feeding in Aplysia. J. Neurosci. 11 (11), 3630-3655 (1991).
- Jing, J., Weiss, K. R. Generation of variants of a motor act in a modular and hierarchical motor network. Curr. Biol. 15 (19), 1712-1721 (2005).
- Azizi, F., Lu, H., Chiel, H. J., Mastrangelo, C. H. Chemical neurostimulation using pulse code modulation (PCM) microfluidic chips. J. Neurosci. Methods. 192 (2), 193-198 (2010).
- Zhurov, Y., Proekt, A., Weiss, K. R., Brezina, V. Changes of internal state are expressed in coherent shifts of neuromuscular activity in Aplysia feeding behavior. J. Neurosci. 25 (5), 1268-1280 (2005).
- Baker, B. J., Kosmidis, E. K., Vucinic, D., Falk, C. X., Cohen, L. B., Djurisic, M., Zecevic, D. Imaging brain activity with voltage- and calcium-sensitive dyes. Cell. Mol. Neurobiol. 25 (2), 245-282 (2005).
- Fejtl, M., Stett, A., Nisch, W., Boven, K. -. H., Möller, A., Baudry, M., Taketani, M. On Micro-Electrode Array Revival. Advances in Network Electrophysiology Using Multi-Electrode Arrays. , 24-37 (2006).
