Isolierung und Immunfärbung Lymphozyten und dendritische Zellen aus Murine Peyer-Plaques

Peyer-Plaques (PP) sind makroskopische Aggregate der organisierten lymphatischen Follikel in der kleinen Darm von Menschen und Mäusen (Abbildung 1) und bilden die primären Standorten, an denen mukosalen Immunantworten gegen diätetische Antigene, symbiotischer Bakterien, mikrobielle Pathogene und orale Impfstoffe ausgelöst werden ^1-4. Im Gegensatz zu anderen peripheren lymphatischen Gewebe wie den Mesenteriallymphknoten fehlt PPs afferenten Lymphgefäße. Als solche adaptive Immunantworten in PPs werden in Reaktion auf Antigene aus dem Darmlumen abgeleitet angetrieben. Die Abtastung wird die luminale Antigene durch den Follikel-assoziierten Epithel (FAE), die sowohl aus Enterozyten und Antigen-Sampling-Zellen als Zellen bekannt M besteht bewerkstelligt. Unterhalb des FAE im subepithelialen Kuppel (SED) Region liegt ein Netz von dendritischen Zellen (DCs) mit Makrophagen, B-Zellen und CD4 ⁺ T-Zellen ^5-9 vermischt. Im Kern jedes PP lymphatischen follicle sind follikulären dendritischen Zellen (FDC) und einem B-Zell-reiche zentrales Keimzentrum, durch T-Zell-reichen Zonen interfollikulären flankiert. Antigen Abtasten durch PPs führt zur Entwicklung von IgA + B-Zellen und CD4 ⁺ Plasmablasten Effektorzellen und Gedächtniszellen dass Saatgut der umgebende Lamina propria und bereitzustellen Immunität gegenüber einem breiten Spektrum an mukosalen Eindringlinge.

Sezieren die komplexen immunologischen Ereignissen mit Antigen Probenahme, Aufbereitung und Präsentation in PPs verbunden ist eine gewaltige Aufgabe, wenn man bedenkt, dass PP-Zellen nur einen winzigen Bruchteil der gesamten lymphatischen Zellen in der Darmschleimhaut bilden. Um in der in-vitro-Charakterisierung der Zellen in diesem Umfeld zu erleichtern, bieten wir ein Protokoll für die Vorbereitung insgesamt Maus PP-Zellen für die durchflusszytometrische und funktionelle Analyse, sowie ein Protokoll für die Vorbereitung PP Kryoschnitten für Immunfluoreszenz und Immunhistologie. Unser Protokoll für die Isolierung, Charakterisierung und Immunfärbung von mouse PP-Zellen ist an sich nicht neu, wie die Tatsache, dass es zahlreiche Hinweise aus mehr als 25 Jahren, dass diese Techniken zu nennen ^5,6,9-11 belegt. Vielmehr bietet unser Protokoll eine optimierte (und visuelle)-Methode für Ermittler sammeln PPs für die erste Zeit. Die Techniken, die wir beschreiben, sind leicht zu beherrschen und leicht nachgeben große Anzahl von Zellen mit> 90% der Lebensfähigkeit der Zellen. Die Kryoschneiden-Protokoll liefert reproduzierbare Schnittserien ideal für Immunfluoreszenzfärbung und konfokale Bildgebung eignet. Darüber hinaus ergänzt unser Protokoll zwei anderen kürzlich JoVE Artikel. Das erste, von Fukuda et al, beschreibt die Verwendung von ligierten ilealen Schleife Assays um die Aufnahme von pathogenen Bakterien, die durch M PP Zellen ¹² zu beurteilen. Die andere, von Geem und Kollegen, beschreibt die Isolierung und Charakterisierung von DCs und Makrophagen aus der Maus Darmschleimhaut, sondern schließt ausdrücklich PPs aus ihrer Analyse ¹³.