隔离和免疫淋巴细胞和树突状细胞的小鼠Peyer氏斑
Summary
理解在派伊尔氏淋巴集结的特定的细胞亚群（PPS），初级感应网站肠相关的淋巴组织的免疫功能有越来越大的兴趣。在这里，我们列出了流式细胞仪分析和PP冰冻切片免疫准备的PP单细胞准备的并行协议。
Abstract
Peyer氏斑（PPS）的肠道相关淋巴组织（GALT）是不可或缺的组成部分，并在肠道的免疫监视和平衡中发挥核心作用。连续采样在肠腔内的颗粒性抗原和微生物PP M细胞在卵泡相关上皮（FAE），运到底层网络的树突状细胞（DC）的，巨噬细胞，和淋巴细胞。在本文中，我们描述了小鼠的PP是（i）解离成单细胞悬浮液，并进行流式细胞仪，及（ii）用于cryosectioning和免疫制备的协议。流式细胞仪，PPS的机械分离，然后通过70微米膜过滤产生单细胞悬液的上皮细胞和大的杂物。用20-25的PP（从四只小鼠）开始，此快速和可重复性的方法产生一个人口> 2.5×10 6细胞> 90％的细胞存活率。对于cryosectioning，新鲜LY孤立的PP都沉浸在最佳切削温度（OCT）中，在液氮快速冷冻，然后切片用冷冻切片机。组织切片（5-12微米），空气干燥，用丙酮或甲醇固定，然后进行免疫标记。
Introduction
Peyer氏修补程序（PPS）是宏观集合体有组织淋巴滤泡整个的小小肠人类和小鼠（ 图1）中存在的和构成的主站点在粘膜免疫应答被发起针对膳食抗原共生细菌，微生物病原体，口服疫苗1-4。与其他外周淋巴组织，如肠系膜淋巴结，PPS缺乏传入的淋巴管。因此，适应性免疫反应的PP中的驱动响应于来自肠腔抗原。管腔抗原的采样来完成的由卵泡关联的上皮（FAE），其中包括被称为M细胞肠细胞和抗原采样单元。上皮子圆顶（SED）的区域中，位于下方的FAE，间杂与巨噬细胞，B细胞和CD4 + T细胞5-9的树突状细胞（DC）的网络。在每个PP淋巴follicl的核心e是滤泡树突状细胞（FDCS）和B细胞丰富的中央生发中心，两侧的T细胞丰富的滤泡区。的PP的查询结果中的发展型IgA + B细胞浆母和CD4 +效应和记忆细胞抗原采样种子周围的固有层，并提供很宽的范围内的免疫力粘膜入侵者。
解剖复杂的免疫抗原采样，处理和呈现在PPS相关的事件，是一项艰巨的任务，考虑到PP细胞只占一小部分的总淋巴样细胞在肠黏膜。为了有助于在体外表征细胞在这样的环境中，我们提供了一个协议，用于制备总鼠标PP细胞流式细胞仪和功能分析，以及用于制备聚丙烯的冷冻切片的免疫荧光显微镜和免疫组化检测的协议。我们的分离，鉴定和免疫组织化学的谅解备忘录的协议ËPP细胞本身并不新颖，所证明的事实，即有超过25年的历史，多次提到，引用这些技术5,6,9-11。相反，我们的协议提供了一个简化的（视觉）的方法收集PPS第一次调查。我们所描述的技术很容易掌握，容易产生大量的细胞与细胞活力> 90％。 cryosectioning协议产生高度重复的连续切片进行免疫荧光染色和激光共聚焦成像非常适合。此外，我们的协议补充其他两个最近的朱庇特的文章。第一，由福田和他的同事，描述了使用结扎回肠环路检测，以评估的致病细菌的吸收，由PP M细胞12。其他的，的GEEM和他的同事，介绍了小鼠肠黏膜的区议会和巨噬细胞的分离和鉴定，但明确排除了PPS从他们的分析13。
Protocol
Representative Results
Discussion
在这篇文章中，我们提供了并行协议的准备PP准备流式细胞仪和功能分析和冰冻切片免疫组化染色的单细胞。这两种方法都高度重复性和容易获得，流式细胞仪和低温恒温器。对于第一次调查应该指出，当脾，总的电池产量PPS是相对贫乏。然而，该协议，概述一般为0.8〜1.2×10共6个 PP细胞从一个单一的鼠标之间的收益率。规模化是可能的，但我们通常不超过20-25 PPS池，因为，在我们的经验?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我们感谢狄仁杰歌（Wadsworth中心流式细胞仪核心）协助细胞分析和海伦·约翰逊（Wadsworth中心动物病理组织核心）的石蜡切片的制备。我们感谢理查德·A·科尔博士（Wadsworth中心光学显微镜核心），激光共聚焦显微镜和图像采集的援助。我们要感谢安迪·本特利（沃兹沃斯中心的照片和插图）与动画的援助。
MDJ支持生命科学研究基金会，霍华德·休斯医学研究所（HHMI）的奖学金。 SA的支持，一个沃兹沃斯中心健康研究公司壁间的博士后研究。这项工作是支持的，部分由美国国立卫生研究院资助HD061916和GM082978。
Materials
| Item | Company | Cat. # | Comments (optional) |
| OCT Compound | Tissue-Tek | 4583 | |
| 7x7x5 mm Base Molds | Fisherbrand | 22-363-552 | |
| ImmEdge Pen | Vector Labs | H-4000 | |
| Superfrost Plus Slides | Thermo Scientific | 4951 | |
| Edge Rite Blade | Thermo Scientific | 4280L | |
| Anti-Mouse CD11c-PE | eBioscience | 17-0114-82 | |
| Anti-Mouse CD45R/B220-APC | BD Pharmigen | 553092 | |
| Anti-Mouse CD3-FITC | BD Pharmigen | 561798 | |
| Anti-Mouse CD4-PE | BD Pharmigen | 553652 | |
| Anti- Mouse CD8-PE | BD Pharmigen | 553032 | |
| Anti-Mouse CD19-PercP | BioLegend | 115531 | |
| Hank’s balanced salt solution (HBSS) without phenol red | Fisher Scientific | 14175-079 | |
| 70 μm cell strainer | BD Falcon | 352350 | |
| Spleen Dissociation Medium | Stem Cell Technologies | 7915 | |
| Goat serum | Invitrogen | 16210-072 | |
| Fc Block | ATCC 2.4.G2 | HB-197 | Supes obtained from cell line 2.4.G2 |
| Curved Scissor | F.S.T | 14061-09 | |
| Cryostat | Leica | 3050S | |
| FACS Calibur | BD | ||
| Countess Cell Counter | Invitrogen | ||
| Hematoxylin | Richard Allan | 7211 | |
| Eosin | Richard Allan | 71304 | |
| Formalin | Starplex Scientific | 3661 | |
Table 1. Reagents and equipment used in this study. |
References
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