구조 연구 생산 이황화 - 안정화 Transmembrane의 펩타이드 단지
Summary
막 임베디드 단백질 도메인 간 상호 작용의 Biophysical 및 생화학 연구는 적절한 학습 자료를 얻는 첫 번째있는 많은 기술적 도전을 직면하고 있습니다. 이 문서는 솔루션을 핵 자기 공명 (NMR) 및 기타 분석 응용 프로그램의 구조 분석에 적합 이황화 – 안정화의 transmembrane의 펩타이드 복합체를 생산하고 정화를위한 프로토콜을 설명합니다.
Abstract
막 단백질의 지질 내장 된 알파 – 나선형 도메인 간의 물리적 상호 작용은 막 단백질 단지의 접이식 및 조립과 같은 transmembrane (TM) 신호와 세포 표면 단백질 수준의 조절, 동적 인 프로세스에서 매우 중요한 역할을한다. 특정 시퀀스의 연결을 운전 구조적 기능을 이해하는 것은 TM의 펩타이드 단지의 정교한 biophysical 및 생화학 분석이 필요합니다. 그러나, TM 도메인의 극단적 인 소수성는 표준 펩타이드 화학 기술을 사용하여 조작하도록 매우 어렵게 만듭니다, 그리고 적절한 학습 자료의 생산은 종종 prohibitively 도전 증명한다. 펩티드는 현재 안정적으로 나선형 conformations 및 양식 단지를 채택 할 수있는 환경을 확인하는 것은 자발적으로 어려움의 추가 수준을 추가합니다. 여기 E.하에 게이 또는 자료에서 이종 dimeric TM의 펩타이드 단지의 생산을위한 절차를 제시 안부난, 따라서 핵 자기 공명에 대한 안정적인 동위 원소 라벨 (NMR) 또는 상대적으로 저렴하게 다른 응용 프로그램이 아닌 천연 아미노산의 설립을 허용. 이 방법의 주요 혁신은 TM 단지는 생산 및 세제, 지질 또는 기타 막 모방 재료로 재구성 할 때 안정적인 화학 양 론적하고 균일 한 구조를 형성 할 수 covalently 관련 (이황화-가교) 어셈블리로 정화된다는 것입니다. 우리는 하나의 TM 도메인 또는 가교 단지를 생산 여부 동등하게 적용하고 새로운 TM 시퀀스에이 방법을 조절하기위한 조언을 제공 표현과 정화에 대한 조심스럽게 최적화 된 절차를 제시한다.
Introduction
이 프로토콜은 세부 사항 우리가 솔루션 NMR을 사용하여 구조 연구 이황화 – 안정화 transmembrane의 단지 (TM) 펩티드를 생성하기 위해 개발 절차를. 절차는 ΔtrpLE1413 융합 시스템 (아래 참조)에 의해 부여 강력한 표현을 활용하여 정의 된 구성의 TM의 펩타이드 단지는 현대적인 다차원 NMR 실험에 사용되는 복잡한 안정적-동위 원소의 분류 기술을 사용하여 생성 할 수 있습니다. 우리는 림프구 – 활성화 immunoreceptors이 (최근 1 검토)은 TM 도메인 간의 상호 작용을 통해 여러 막 단백질 subunits에서 조립하는 방법에 대한 중요한 새로운 정보를 공개 여러 NMR 구조를 결정하기 위해 이러한 기술을 고용하고 있습니다. 이 기술은 다른 많은 막 단백질 시스템뿐만 아니라 솔루션 NMR뿐만 아니라 다운 스트림 분석 방법의 다양한 적용됩니다. 여기에 주어진 예는 기본 시스테인 잔류 물을 활용하는 동안자연스럽게 이황화 – 보세 단백질을 모방 복잡한을 만들려면 디자인은 동일하게 일반적으로 이러한 게이 및 이종 dimeric TM 단지와 같은 약한 비 공유 결합 상호 작용에 의해 함께 개최됩니다 복합체를 안정화 할 수 있도록 설계 이황화 채권을 생성에 적합합니다 표피 성장 인자 수용체는 (EGFR) 가족 단백질 2-4 또는 heterodimeric의 αβ 인테그린 단지 5,6.
같은 지방질에서 파생 된 것과 같은 매우 소수성 펩타이드 시퀀스 이중층 – 스패닝 TM 단백질의 일부 것은 생화학 및 biophysical 연구 대단히 어려운 과목입니다. 표준 단백질과 펩타이드 화학 기술을 사용하여 조작하는 것은 매우 어려운 것뿐만 아니라, 그들은 종종 세포에 매우 독성이 있으므로 recombinantly 생산하기가 어렵습니다. 우리 7,8 등 9-11이 가지고에서 프레임 카르복시 – 터미널로 세균 이러한 어려운 펩타이드 시퀀스를 표현 상당한 성공E.에서 파생 된 ΔtrpLE1413 순서의 수정 된 버전 fusions 대장균 TRP 오페론 12. 이 시퀀스로 인코딩 ~ 13 kDa trpLE 폴리펩티드는 T7 프로모터에 따라 높은 수준의 생산 할 수 있으며 완전히 독성 및 / 또는 불안정에 관한 문제가 피할 아르 포함 단체로 지역화되어 있습니다. 아미노 터미널 9 히스티딘 태그 13 trpLE 순서에서 내부 메티오닌과 시스테인 잔류 물을 제거 금속 이온 친화도 크로마토 그래피에 의해 정화되고 소화 할 14 수 trpLE – 펩타이드 fusions는 시안 브로마이드 (CNBr을 사용하는 추가하여 순서의 변경 ) 원하는 펩타이드 시퀀스를 공개합니다. 우리는 성공적으로 많은 사 등의 TM 도메인을 포함 멤브레인 단백질 조각을 대표 trpLE fusions 등의 12 개의 시퀀스 이상을 표현하기 위해이 시스템을 사용하면 (7,8 및 게시되지 않은 결과, 또한 토론 섹션을 참조).
이 프로토콜의 주요 혁신은 구조화 매우 저조한 용해 trpLE-TM fusions 효율적으로 간소화 된 워크 플로우의 맥락에서 이황화 – 가교가 될 수있는 아래의 조건을 식별합니다. 높은 수율 표현, 취급 및 펩타이드 제품의 정화의 여러 측면은 철저하게 최적화하고, 여기에서 제시 한 권고는 비 이황화 – 가교 (monomeric) TM 펩타이드 제품의 생산을위한 동등하게 관련이되어 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
trpLE-TM fusions의 표현이 있습니다. 우리의 경험에서 trpLE-TM fusions이 저조한 37 ° C에서 풍부한 문화 매체에 표현되며, 여기에 설명 된 문화 조건 수율이 범위를 1-4 TM 도메인에서 포함 된 다양한 시퀀스에 대해 성공적으로 증명 50에서 150 밀리그램 / 순수 그대로 융합의 L. Fusions 인코딩은 세 또는 네 TM GPCR 조각 (인간의 CCR5 각각 TM1-TM3 및 TM4-TM7), 또는 인간의 신호 펩티드 peptidase (4 TM 도메인, 심판 …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
멕과 빅토리아 정부 (VESKI 혁신 동지,이 작품에 대한 자금 지원은 국민 건강과 호주의 의학 연구위원회 (WEHI에 독립적 인 연구소 인프라 지원 계획은 [IRIISS] 부여 멕과 MJC에 NHMRC 프로젝트 보조금 1,011,352)에 의해 제공된다; WEHI에 빅토리아 주 정부 운영 인프라 지원). 멕는 호주 연구 협의회의 엘리자베스 2 세 여왕 동지이다. EFXB는 멜버른 대학에서 노마 힐다 슈스터 장학금 프로그램의 지원을 인정합니다.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalogue Number | Comments |
| Cyanogen bromide | ALDRICH | P.No- C91492,CAS-506-68-3 | HAZARDOUS SUBSTANCE. DANGEROUS GOODS. Very toxic by inhalation, in contact with skin and if swallowed. Contact with acids liberates very toxic gas. Very toxic to aquatic organisms, may cause long-term adverse effects in the aquatic environment. |
| Trifluoroacetic acid | SIGMA-ALDRICH | P.CODE-1000984387, CAS Number 76-05-1 | HAZARDOUS SUBSTANCE. DANGEROUS GOODS., Causes severe burns. Harmful by inhalation. Harmful to aquatic organisms, may cause long-term adverse effects in the aquatic environment. |
| 2-Mercaptoethanol | SIGMA-ALDRICH | P.No M7154, CAS Number 60-24-2 | HAZARDOUS SUBSTANCE. DANGEROUS GOODS. Toxic by inhalation, in contact with skin and if swallowed. Irritating to skin. Risk of serious damage to eyes. May cause sensitization by skin contact. Very toxic to aquatic organisms, may cause long-term adverse effects in the aquatic environment. |
| 1,1,1,3,3,3-Hexafluoro-2-propanol | SIGMA-ALDRICH | Product Number 52512, CAS-No. 920-66-1 | HAZARDOUS SUBSTANCE. DANGEROUS GOODS. Harmful by inhalation and if swallowed. Causes burns. |
| Formic acid | Merck KGaA | K41186564 | Flammable liquid and vapour. Causes severe skin burns and eye damage. |
| Urea | UNIVAR, AJAX FINECHEM | Product Number, 817, CAS-No 57-13-6 | When heated, decomposes to carbon dioxide and ammonia; if burned, emits small amounts of nitrogen oxides. Can cause redness and irritation of skin and eyes. |
| GUANIDINE HYDROCHLORIDE | Amresco | P.No-M110, CAS Number: 50-01-1 | Harmful if swallowed, Causes serious eye irritation,Causes skin irritation, Acute Toxicity Oral, Skin Irritant, Eye Irritant. |
| TRITON X-100 | SIGMA | Product Number- T8532 CAS No: 9002-93-1 | Triton X-100 is a nonionic detergent, 100% active ingredient, which is often used in biochemical applications to solubilize proteins. Triton X-100 has no antimicrobial properties and considered a comparatively mild non-denaturing detergent |
| His-Select Nickel-Affinity gel | SIGMA-ALDRICH | Catalog Num- P6611 | IS-Select Nickel Affinity Gel is an immobilized metal- ion affinity chromatography (IMAC) product. The HIS-Select Nickel Affinity gel is a proprietary quadridentate chelate on beaded agarose charged with nickel that is designed to specifically bind histidine containing proteins. |
| (-)-Glutathione, oxidized | SIGMA-ALDRICH | Catalog num 150568 | |
| Misonix S-3000 sonicator | QSONICA | S-3000 (discontinued) | Max power output 600 watts. 1/2-inch replaceable-tip probe takes 1/2-inch high-intensity, high-volume tips and a range of high-intensity, low-volume tips. Closest models currently available from this company are Q500 and Q700. |
| RP-HPLC: BioLogic DuoFlow chromatography system, Software Version 5.3 | Bio-Rad Laboratories | Catalog Num 760-0047, Config No: AU500571, Serial No: 484BR3705 | Peptides binds to reverse phase HPLC columns in high aqueous mobile phase and are eluted from RP HPLC columns with high organic mobile phase. In RP HPLC peptides are separated based on their hydrophobic character. Peptides can be separated by running a linear gradient of the organic solvent. |
| Prep HT C3 ZORBAX 300SB-Analytical HPLC Column, 21.2 x 150 mm, 5 μm particle size | Agilent | Product No: 895150-909 | Reversed-phase HPLC colum |
| NuPAGE 12% Bis-Tris Gels | Life Technologies | NP0341BOX | Pre cast gels for protein electrophoresis |
| Slide-A-Lyzer G2 Dialysis Cassettes, 3.5K MWCO | Thermo Scientific | Product No: 87724 | Sample dialysis |
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