Aqui apresentamos um método histológico para captura, rotulagem, opticamente limpar e imagem da interface tecido intacto cérebro em torno de microdispositivos cronicamente implantados no tecido cerebral dos roedores. Os resultados das técnicas que compõem este método são úteis para a compreensão do impacto dos vários penetrantes cérebro-implantes em seu tecido circundante.
A investigação sobre o design e utilização de micro-cérebro implantados, como matrizes de microeletrodos, visa produzir dispositivos clinicamente relevantes que interagem com o tecido circundante cronicamente cérebro. Tecido circundante destes implantes é pensado para reagir à presença dos dispositivos ao longo do tempo, o qual inclui a formação de um isolante "cicatriz glial" em volta dos dispositivos. No entanto, a análise histológica destas alterações do tecido é normalmente realizado após o explantar dispositivo, num processo que pode perturbar a morfologia do tecido de interesse.
Aqui demonstramos um protocolo em que os dispositivos implantados-corticais são recolhidos em torno intacto tecido cerebral dos roedores. Descrevemos como, uma vez perfundidos com fixador, os cérebros são removidos e cortados de modo a evitar a dispositivos explantar. Nós delineamos rotulagem anticorpo fluorescente e métodos de compensação óptica úteis para a produção de um tecido, informativo ainda grossasecção. Finalmente, demonstramos a montagem e imagiologia destas secções de tecido, a fim de investigar a interface biológica em torno cerebrais implantados dispositivos.
O campo de pesquisa tem como objetivo neuroprótese para ajudar as pessoas que sofrem de várias deficiências e transtornos ignorando estruturas doentes ou danificadas no corpo através de interface SNC 1,2 dispositivos. Microdispositivos Brain-implantados, tais como matrizes de microeletrodos (MEA), pode ser utilizado para gravar ou estimular as estruturas cerebrais e, assim, permitir o estabelecimento de longo prazo interfaces entre electrónica e tecido do SNC 3-5. MEAs penetrantes, os dispositivos que são conduzidos para o tecido cerebral, em particular como uma promessa bidireccionais interfaces devido à proximidade em que se apresentam os eléctrodos a um conjunto relativamente pequeno de neurônios próximos 6.
No entanto, as respostas complexo tecido resultam da implantação a longo prazo de MEAs penetrantes, muitas vezes resultando em variáveis e gradualmente degradar electrofisiológicas sinal-para-ruído mais dias ou meses, e um aumento na impedância eléctricadade entre os sites de eletrodos e terra 7,8. As origens putativas destas alterações incluem a activação de microglia, astrocitose reactiva ao longo dos microdispositivos, e uma perda ou migração de neurónios a partir do tecido circundante para dispositivos implantados 9-11. Um grande desafio para a compreensão dessas alterações no tecido em torno crônicas AAM, a penetração é a dificuldade na captação de dados histológicos da interface tecido circundante intacto dispositivos cronicamente implantados 12. A análise histológica do tecido com a interface do dispositivo / tecido ainda presente seria melhorar os atuais dispositivo de remoção de protocolos histológicas. Com um dispositivo sem perturbações restante no tecido, o impacto biológico das interacções relativamente subtis, tais como a utilização de revestimentos biocompatíveis 13,14 ou a compensação eléctrica da superfície do eléctrodo, 15,16 podem ser visualizados e analisados em relação ao implante.
Here que demonstrar um método para coletar, processar e imagem da interface microdispositivo intacta por análise de microscopia baseada detalhada do tecido cerebral circundante. Neste método, o dispositivo e o tecido cerebral circundante são recolhidos dentro de uma secção de tecido espesso (> 250 um), utilizando um vibratome. Para melhorar a penetração do rótulo histológica para estas rodelas grossas, etiquetas fluorescentes histoquímicos e imuno-histoquímicos são aplicados em concentrações elevadas em soluções contendo soro de bloqueio e um detergente para vários dias. Uma solução de limpeza óptico é utilizado para melhorar a profundidade de imagem de microscopia, eo tecido é montado em dois lados para câmaras de laser subsequente por microscopia confocal 17. Para capturar a interface completa histológica, uma fase controlada por computador é utilizado durante a translação de imagem para recolher z-stack panoramas ao longo do comprimento dos implantes. Além de imagens aplicadas etiquetas de tecido, a coleta de reflexão laser de volta a partir de implantese transmissão de luz através do tecido ajuda ambos localizar a interface do dispositivo em relação ao tecido circundante. Tecidos preparados com este "dispositivo de captura-Histologia" (DCHist) protocolo fornece acesso às imagens morfologia preservada tecido / dispositivo de interações e, assim, melhora a anteriores dispositivo de remoção de protocolos histológicos 18.
O "dispositivo de captura-Histologia" método (DCHist) demonstraram aqui permite a avaliação histológica perto de interações morfologia preservada entre o tecido cerebral e implantes de tecidos. Recolha de tecidos DCHist requer a separação cuidadosa dos componentes montados no crânio do dispositivo a partir de componentes implantados no cérebro. DCHist também exige a coleta de uma fatia de tecido grosso histológico (> 250 mm). Estes cortes de tecido, uma vez rotulado, limpo, montado, e com imagens, pode fornecer informações novas para a implantação ou lesão resposta crônica após a dispositivos de longa permanência. Usando ferramentas avançadas de microscopia, a interface entre o tecido e o dispositivo pode ser trabalhada e analisada em grande detalhe, como mostrado nas Figuras 3-5.
As técnicas apresentadas na sua forma actual contam com a capacidade de, lentamente, embora a escavar headcap feita a partir de duas partes de cimento dentário e Kwik-Sil para baixo para o ponto de implantação do dispositivo.Utilizando cimento dental que pode ser gravado ou de outro modo removida para longe e um elastómero de silicone transparente através da qual pequenas tesouras pode ser guiado visualmente auxiliar muito sucesso em separar o dispositivo implantado a partir dos seus componentes montados no crânio. A tentativa de cortar o dispositivo sob o crânio acima do cérebro e, a fim de recolher lo in situ não é recomendado, porque o implante crânio montado irá ser puxado para fora do cérebro, de uma quantidade significativa.
Embora mais finos, implantes menores, tais como AAM haste individuais de NeuroNexus, são mais passíveis de DCHist, os princípios não estão restritos a hastes de dispositivos individuais ou matrizes de microeletrodos. Recolha e estratégias de imagem são amplamente aplicáveis a haste multi-dispositivos e implantes maiores, tais como cânulas, com os requisitos é que eles devem ser separados a partir de qualquer montagem do crânio e recolhido dentro de uma secção de tecido de espessura. Embora os autores estão focados na análise do tecidocircundantes implantes corticais, dispositivos movidos mais fundo no cérebro também pode ser recolhida e trabalhada. A profundidade de inserção do implante não deve afectar a captura do implante de uma fatia, desde que o dispositivo não se desviar muito de o ângulo de inserção conhecidas.
Existem limitações à aplicação útil do método DCHist. Seções de tecido cerebral são difíceis de imagem através de centenas de micrômetros, especialmente nas áreas de substância branca, embora as soluções de compensação óptica pode melhorar muito profundezas de imagem em vários tecidos 21. Para melhorar ainda mais a profundidade de imagem, de dois fotões microscopia de excitação podem ser empregues juntamente com a limpeza óptica descrita.
Outra limitação potencial do método descrito podem ser os métodos específicos e anticorpos imuno fluorescentes utilizados pelos investigadores. Difusão passiva normalmente dirige a incorporação destes marcadores através de tecido fixadoe em sites de ligação a antígenos. As concentrações finais de anticorpo de trabalho deve ser determinada por investigadores numa base caso a caso para maximizar a penetração da etiqueta, evitando níveis elevados de etiquetagem de fundo. Rotulagem de anticorpos não deve ser variável entre fatias que são processados de forma idêntica, mas de diferentes anticorpos podem variar consideravelmente na sua capacidade de penetrar e marcar o seu antigénio, com alguns anticorpos facilmente etiquetar antigénios muitas centenas de micrómetros de profundidade e de outros antigénios de etiquetagem apenas dezenas de micrómetros de profundidade. Descrevemos melhorar esta difusão por aplicação de etiquetas de anticorpos em concentrações superiores típicos, com vários dias de aplicação, e de uma solução contendo detergente diluído e bloqueio de soro. Periodicamente lançando as fatias também promove ainda rotulagem. Passos de recuperação de antigénio e os processos de fixação adicionais (por exemplo glutaraldeído microondas, etc) pode ser adequado para antigénios específicos. Anticorpo secundário fluoroch-conjugados roma pode também variar no seu desempenho rotulagem de espessura, embora isto não tenha sido observado pelos autores usando rótulos de Alexa Fluor da Invitrogen. Alternativamente, os indivíduos animais transgénicos que expressam proteínas fluorescentes em tipos de células de interesse pode ser utilizada para evitar problemas com a penetração etiqueta de anticorpo, tal como muitas proteínas fluorescentes, tais como eGFP, conservam a sua fluorescência após tratamento com formaldeído, e pode ser imediatamente visualizado em secções de tecido.
DCHist é um poderoso conjunto de técnicas para capturar e analisar o impacto de microdispositivos implantados no tecido cerebral. Acoplamento este protocolo histológico com in vivo de avaliação de qualidade e de eletrofisiologia de dados de eletrodos de impedância 22 poderia melhorar muito a nossa compreensão das fontes biológicas de variabilidade fisiologia e degradação. O campo de dispositivos implantados protéticos neurais em particular, podem beneficiar com a detalhada DCHist imaging da interface de dispositivo / tecido intacto para informar um maior desenvolvimento de dispositivos biologicamente neutros MEA.
The authors have nothing to disclose.
Todos os experimentos foram realizados sob a supervisão da Animal Care Purdue e do Comitê do Programa de Uso e Animais de Laboratório da Universidade Purdue.
Este trabalho foi patrocinado pela Defense Advanced Research Projects Agency (DARPA) Microsystems Tecnologia Office (OMP), sob os auspícios do Dr. Jack W. Judy (jack.judy @ darpa.mil), como parte do Programa de Tecnologia de confiança Neural, através de Espaço e Guerra Naval Systems Command (SPAWAR) Systems Center (SSC) Pacific Grant No. N66001-11-1-4013.
Os autores gostariam de agradecer Mikhail Slipchenko, Don Ready, Greg Richter, Aaron Taylor e Kevin Eliceiri para compartilhar seus conhecimentos microscopia.
Reagents | |||
Hoechst 33342 | Invitrogen | 14533 | DNA marker |
Rabbit anti-Iba1 | Wako (Japan) | 019-19741 | Monocyte antibody |
Dental acrylic | Lang Dental (various distributors) | Jet Denture Repair Powder & Liquid | Headcap construction |
Kwik-Sil | World Precision Instruments | KWIK-SIL | Covering exposed cranial implants |
Normal goat serum | Jackson ImmunoResearch | 005-000-121 | Tissue processing |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100-500ml | Tissue processing |
Urea | Sigma-Aldrich | U4883 | Clearing solution |
Glycerol | Sigma-Aldrich | G20225 | Clearing solution |
Equipment | |||
Curved micro-scissors | World Precision Instruments | 14208 | Cutting implant before removing brain |
Razor blades | Ted Pella | (various sizes) | For use with Brain Block |
Acrylic Brain Matrice | Ted Pella | 15054 | Brain Block to create initial plane in tissue |
Plastic slides | Ted Pella | 260225 | Mounting tissue |
Cover glass | Ted Pella | (various sizes) | Mounting tissue |
Electrode arrays | NeuroNexus Technologies | (various designs) | Example MEAs |
Vibratome | Leica | VT1000 S | Specific system used in presented method |
Vibratome blades | (various suppliers) | Collecting slices | |
24-well plates | (various suppliers) | Storing and processing tissue slices | |
Confocal microscope with motorized XY-scanning stage | Carl Zeiss Microscopy | Zeiss LSM 710 and ‘Zen 2010’ software | Specific system used in presented method |
Soldering iron | (various suppliers) | Excavating headcap |