Gene reventado Usando Gal4 en pez cebra

Mutagénesis insercional ha demostrado ser un enfoque poderoso para la disección de la función de genes en diversos sistemas modelo a partir de organismos unicelulares como las bacterias y levaduras para los organismos multicelulares tales como los ratones y las plantas. Cualquier ADN exógeno (virus, plásmido o transposón) puede servir como un mutágeno mediante la interrupción de los elementos esenciales de los genes tales como exones o promotores. El objetivo efectivo de tales enfoques simples es extremadamente pequeña en grandes genomas complejos, ya que los exones representan sólo el 1-3% de un genoma típico de los vertebrados. Tamaño de destino efectivo pequeño puede ser superada por las tasas de integración muy alto por vectores, como lo demuestra el tremendo éxito de la mutagénesis de inserción retroviral en el pez cebra ^11,12. Por el contrario, los intrones comprenden aproximadamente el 20-30% de los genomas de vertebrados. En el pez cebra, vectores de mutagénesis de inserción basado en transposón que introducen efectivamente nulo o hypomorphic mutaciones severas sobre la integración en los intrones se han llamado "gen romper transposons "(GBTS) ^8-10. Para la integración eficiente trampa de genes, que utilizan un transposón mínima Tol2 ^13,14. Mutagenicidad de GBTS se basa en peces derivados de aceptor de empalme y secuencias de terminación / poliadenilación de la transcripción. Los elementos responsables de GBT mutagenicidad están flanqueadas por sitios loxP directos para la escisión por la recombinasa Cre. Por lo tanto, la inyección de ARNm de Cre conduce a la reversión eficiente de mutaciones inducidas por GBT, a pesar de que algunas secuencias de transposones permanecen en el locus de integración ^{de 9,10.}

Los vectores GBT recientemente publicados utilizan mRFP como el reportero ^9,10 trampa de genes, dando lugar a dos posibles deficiencias. En primer lugar, no se sabe qué fracción de los genes de pez cebra se expresa a un nivel lo suficientemente alto para ser detectados por las proteínas de fusión reportero directos fluorescentes. En segundo lugar, se espera que sólo un pequeño subconjunto de los genes que tienen funciones esenciales. Se ha estimado que sólo hay 1,400-2,400 genes necesarios para desarroll pez cebrant ^15,16. No se espera que la mayoría de los mutantes de genes trampa para mostrar fenotipos abiertas y por lo tanto tendrá una utilidad limitada. Para superar estas dos limitaciones, hemos modificado GBT-R15 ^9,10 a utilizar con Gal4-VP16 como el reportero trampa de genes primaria (Balciuniene et al. En preparación). Al igual que en agosto, menos mRFP en GBT-R15, el sitio de inicio de la traducción fue retirado de Gal4-VP16. Para la detección directa de eventos de trampa de genes, nuestros vectores contienen un reportero EGFP bajo el control de 14x Gal4 UAS ^17,18.

Varias características adicionales se han diseñado en nuestra bipartito trampa de genes del vector. Los UAS casete eGFP está flanqueado por sitios FRT directos (chevrons grises en la Figura 1). La inyección de la recombinasa Flp mRNA lleva a la escisión de los UAS: Casete eGFP, dejando a la mutación de genes trampa desmarcado por eGFP fluorescencia. Entonces puede ser utilizado en las líneas transgénicas que marcan los tejidos específicos o eventos de desarrollo de la fluorescencia de GFP. Al igual que en otraGBTS, todo el casete de trampa de genes está flanqueado por sitios loxP directos (pentágonos abiertos en la Figura 1). Esto hace que los eventos de genes trampa reversible mediante la expresión de la recombinasa Cre, se establece fácilmente una prueba de relación de causalidad entre una integración específica de trampa de genes y fenotipo observado (Figura 2). Finalmente, la casete de trampa de genes está flanqueado por sitios de meganucleasa I-SceI invertidas (triángulos negros en la Figura 1). En Drosophila, integraciones transposón a menudo se convierten a deleciones (deficiencias) por escisión imprecisa del elemento P. No hay evidencia de que la escisión del transposón Tol2 (o cualquier otro transposón activo en los vertebrados, como la Bella Durmiente, PiggyBac o Ac / Ds) puede dar lugar a supresiones. Por lo tanto, se incluyeron sitios de I-SceI como un método sustituto potencial para la inducción de deleciones, a pesar de que no hay evidencia de que la I-SceI puede inducir deleciones en el pez cebra. Cabe señalar que mientras que la I-SceI Meganucleasa se ​​puede utilizar para facilitar la transgénesis en el pez cebra, la escisión de ADN por meganucleasa I-SCE se usa para estudiar los mecanismos de reparación del ADN, incluyendo propenso a errores de extremos no homólogos de unión, en la levadura y células de mamíferos ^19-22.

La integración de nuestra trampa gen vector puede dar lugar a la expresión de eGFP por dos mecanismos diferentes. El primero es un verdadero acontecimiento trampa de genes (Figura 1 C): el vector se integra en un gen (IMG para insertionally gen mutado), una transcripción de la fusión entre el 5 'del transcrito endógeno IMG y la Gal4-VP16 se hace y se tradujo en una proteína de fusión que contiene el N-terminal de la proteína codificada por IMG y Gal4-VP16. Esta proteína de fusión se une a los 14x UAS y activa la transcripción de EGFP. El segundo evento, menos deseable es un potenciador trampa (Figura 1D): el promotor mínimo delante de eGFP cae bajo el control de un promotor de cerca del sitio de integración, que conduce a la producción de EGFP en el ABsencia de producción Gal4-VP16. En nuestra estimación, el 30-50% de los eventos EGFP expresión se deben a una trampa potenciador y un 50-70% se debe a una trampa gen ²³ (Balciuniene et al., En preparación). Para distinguir entre estas dos clases de eventos, hemos hecho una 14xUAS: mRFP línea transgénica (Figura 1B), por conveniencia marcada por la lente específica γCry: (. Balciuniene et al, en preparación) GFP. Eventos trampa de genes se verifican por la co-expresión de GFP y RFP (comparar C y D en la Figura 2).

En la pantalla de nuestro piloto, hemos recuperado más de 40 eventos de genes trampa después de cribado 270 F0 peces inyectados con una mezcla de ADN transposón y mRNA transposasa. Dos de nuestras integraciones genes trampa se han producido en los genes con los publicados anteriormente mutantes inducidos químicamente: NSF y la RPF. Los fenotipos de los mutantes de inserción nuestra ^tpl6 nsf y ^tpl24 flr son superficialmente indistinguible del fenotipos de los correspondientes mutantes inducidos químicamente. También tomamos nota de que los acontecimientos de genes trampa aparecen sesgados hacia los intrones cerca del extremo 5 'de los genes, lo que aumenta la probabilidad de alelos nulos. Hacemos observar algún grado de UAS silenciamiento (variegación) en todas nuestras líneas de genes trampa, y algunos loci son claramente más susceptibles al abigarramiento que otros. No creemos que la UAS silenciamiento es un problema importante para la propagación de las líneas de genes trampa, ya que hemos sido capaces de propagarse fácilmente todas nuestras líneas de trampa de genes a través de al menos cinco generaciones mediante la selección de la expresión de GFP sola.