Gene Trapping Usando Gal4 em Zebrafish

Mutagénese insercional provou ser uma abordagem poderosa para dissecar a função de genes em vários sistemas de modelo a partir de organismos unicelulares, como bactérias e leveduras para os organismos multicelulares, tais como ratos e plantas. Qualquer DNA exógeno (vírus, transposão ou plasmídeo) pode servir como um agente mutagénico, ao interromper elementos essenciais de genes, tais como os exões ou promotores. O alvo eficaz de tais abordagens simples é extremamente pequeno em grandes genomas complexos, uma vez que compreendem exões apenas 1-3% de um genoma animal vertebrado normal. O tamanho pequeno alvo eficaz pode ser superada pelas taxas de integração muito alto vetoriais, como exemplificado pelo tremendo sucesso de mutagénese insercional retroviral em zebrafish ^11,12. Em contraste, os intrões compreendem cerca de 20-30% dos genomas de vertebrados. No peixe-zebra, vetores mutagénese de inserção à base transposon que efetivamente introduzir mutações hypomorphic graves na integração nulo ou em íntrons foram nomeados "transposo gene quebrarns "(GBTS) ^8-10. Para a integração armadilha gene eficiente, eles usam uma Tol2 transposon mínimo ^13,14. Mutagenicidade de GBTS depende de emenda aceitante derivados de peixe e as sequências de terminação / poliadenilação transcrição. Os elementos responsáveis ​​pela GBT mutagenicidade são acompanhadas por sítios loxP directos para a excisão de recombinase Cre. Assim, a injecção de Cre ARNm conduz à reversão eficaz de mutações induzidas por GBT, embora algumas sequências de transposões permanecer no locus integração ^9,10.

Os vetores GBT recentemente publicados usar MRFP como o repórter ^9,10 armadilha gene, levando a duas possíveis deficiências. Em primeiro lugar, não se sabe qual a fracção de genes de peixe-zebra são expressas a um nível suficientemente elevado para ser detectado por proteínas de fusão repórter fluorescentes directos. Em segundo lugar, apenas um pequeno subconjunto de genes que se espera que tenham funções essenciais. Estima-se que existem apenas 1,400-2,400 genes necessários para developme zebrafishnt ^15,16. A maioria dos mutantes de armadilha de genes não são esperados exibir os fenótipos evidentes e, por conseguinte, têm utilidade limitada. Para superar estas duas limitações, modificamos GBT-R15 ^9,10 para usar com Gal4-VP16, como o gene repórter armadilha primária (Balciuniene et al. Em preparação). Tal como acontece com AGO-menos MRFP em GBT-R15, o local de início da tradução foi removida da Gal4-VP16. Para a detecção directa de eventos de armadilha de genes, os vectores contêm um repórter eGFP sob controlo de 14x Gal4 UAS ^17,18.

Vários recursos adicionais são projetados em nossa bipartido vetor armadilha gene. Os UAS: gaveta eGFP é ladeada por locais DRF diretos (chevrons cinza na Figura 1). A injeção de Flp recombinase mRNA leva a excisão das UAS: gaveta eGFP, deixando a mutação armadilha gene não marcado por eGFP fluorescência. Ele pode então ser utilizado em linhas transgénicas que marcam tecidos específicos ou eventos de desenvolvimento de fluorescência da GFP. Como em outrosGBTS, toda a cassete de armadilha gene é flanqueado por sítios loxP directos (pentágonos abertas na Figura 1). Isso faz com que os eventos de armadilha de genes reversível por expressão de Cre recombinase, prontamente, que estabelece a prova de relação de causalidade entre a integração específica armadilha de genes e observado o fenótipo (Figura 2). Finalmente, a cassete de armadilha de genes é flanqueado por sítios invertidas meganuclease I-Scel (triângulos pretos na Figura 1). Em Drosophila, integrações de transposons são muitas vezes convertidos em deleções (deficiências) por excisão imprecisa do elemento P. Não há evidências de que a excisão de Tol2 transposon (ou qualquer outro transposon ativo em vertebrados, como A Bela Adormecida, PiggyBac ou Ac / Ds) pode levar a exclusões. Por isso, incluímos sites de I-SCEI como um método substituto potencial para indução de deleções, mesmo que não haja nenhuma evidência de que I-SCEI pode induzir eliminações no peixe-zebra. Deve notar-se que, enquanto que Mega-Scelnuclease pode ser utilizado para facilitar a transgénese em peixes-zebra, a clivagem de ADN de I-Scel meganuclease é utilizada para estudar os mecanismos de reparação de ADN, incluindo a extremidade não homóloga juntando propensa a erros, de levedura e células de mamíferos ^19-22.

Integração do nosso vector armadilha de genes pode levar à expressão eGFP por dois mecanismos diferentes. O primeiro é um verdadeiro evento armadilha de genes (Figura 1C): o vector se integra num gene (IMG para Mutante por inserção do gene), um transcrito de fusão entre a 5 'do transcrito IMG endógeno e o Gal4-VP16 é feita e traduzida numa proteína de fusão contendo a extremidade N-terminal da proteína codificada pelo IMG e Gal4-VP16. Esta proteína de fusão se liga ao UAS 14x e activa a transcrição de eGFP. O segundo caso, menos desejável, é uma armadilha de intensificador (Figura 1D): o promotor mínimo na frente de eGFP cai sob o controlo de um intensificador de perto do local de integração, o que leva à produção de eGFP na abNesse aspecto de produção Gal4-VP16. Em nossa estimativa, 30-50% dos eventos de expressão eGFP são devido a uma armadilha enhancer e 50-70% são devido a uma armadilha gene ²³ (Balciuniene et al., Em preparação). Para distinguir entre essas duas classes de eventos, fizemos uma 14xUAS: linhagem transgênica MRFP (Figura 1B), por conveniência marcada pela específico lente γCry: (. Balciuniene et al, em preparação) GFP. Eventos gene trap são verificados por co-expressão da GFP e RFP (comparação C e D na Figura 2).

Em nossa tela piloto, recuperamos mais de 40 eventos de trap gene após triagem 270 F0 peixes injetados com uma mistura de DNA transposon e mRNA transposase. Duas de nossas integrações armadilha gene ter ocorrido em genes com previamente publicados mutantes induzidas quimicamente: NSF e flr. Os fenótipos de nossa Mutantes insercionais ^tpl6 nsf e flr ^tpl24 são superficialmente indistinguível do fenótipos dos correspondentes mutantes induzidas quimicamente. Observamos também que os eventos de armadilha de genes apareça inclinado para os intrões perto da extremidade 5 'de genes, aumentando assim a probabilidade de alelos nulos. Fazemos observar algum grau de silenciamento UAS (variegation), em todas as nossas linhas de armadilha gene, e alguns loci são claramente mais suscetíveis a variegation do que outros. Nós não acreditamos que UAS silenciamento é um problema significativo para a propagação de linhas armadilha gene, como temos sido capazes de se propagar facilmente todas as nossas linhas de armadilha gene através de pelo menos cinco gerações, selecionando para a expressão GFP sozinho.