T6SS aracılı Bakteriyel Rekabet Monitör A Görsel Assay
Summary
Biz aracılık bakteriyel rekabet izlemek için kalitatif bir testtir tarif<em> Pseudomonas aeruginosa</em> Tip VI salgı sistemi (T6SS). Deneyi taşıyan Escherichia coli hedef hücrelerin hayatta kalma / öldürme dayanır<em> LacZ</em>-Muhabiri. Bu teknik T6SS-yetkin mikroorganizmaların bakterisidal / bacteriostasis aktiviteyi değerlendirmek için ayarlanabilir.
Abstract
Tip VI salgılama sistemleri (T6SSs) Gram-negatif bakteriler hedef hücrelerin 1,2 içine çeşitli proteinlerin taşınması ve enjekte izin veren moleküler nanomakineler vardır. T6SS 13 temel bileşenden oluşur ve bakteriyofajlar 3 kuyruk tüp ile yapısal benzerlikler sergilemektedir. Faj bir tüp ve hedef bakterilerin hücre zarfı nüfuz ve DNA enjekte etmek için bir delici aleti kullanır. Bu T6SS yüzeye etkileyiciler ve toksinler sürücü bakteriyel hücre zarf içinde belirli bir yol oluşturarak ters bakteriyofaj cihaz önerilmiştir. Bu süreç ayrıca alınabilir ve T6SS cihaz böylece bu hedeflerin içine enjekte etkileyiciler, bakteri temas halinde olan diğer hücreler ile delebilir olabilir. Kuyruk tüp ve T6SS ve delme cihazı parçaları sırasıyla 4,5, Hcp ve VgrG proteinler ile yapılır.
T6SS çok yönlülüğü ler ile kanıtlanmıştırçeşitli bakteriyel patojenler kullanarak tudies. Vibrio cholerae T6SS bir C-terminal aktin çapraz-bağlayıcı etki 6,7 taşıyan bir "gelişmiş" VgrG enjekte ökaryotik konak hücrelerin, hücre iskeleti şeklini olabilir. Bir başka çarpıcı örnek son zamanlarda bu nedenle spesifik mikrobiyal nişler ve rekabetçi bir ortamda 8,9,10 bakteri kurulması teşvik, bir T6SS-bağımlı bir şekilde bakterileri hedef ve öldürmek mümkün Pseudomonas aeruginosa ile belgelenmiştir.
İkinci durumda, yani üç T6SS-salgılanan proteinler, Tse1, Tse2 ve Tse3 hedef bakteri (Şekil 1) enjekte toksinler gibi tespit edilmiştir. Donör hücre Tsi1, Tsi2 ve Tsi3 bağışıklık proteinleri 8,9,10 aracılığı ile bir anti-toksin mekanizması yoluyla bu efektörlerinin zararlı etkisi korunmaktadır. T6SS-yetkin bakteriler s co-yetiştirilmektedir Bu antimikrobiyal aktivite izlenebilirDiğer bakteri türleri ile veya aynı türün 8,11,12,13 arasında T6SS-inaktif bakteri ile rekabet içinde Olid yüzeyler.
Mevcut veriler antibiyotik üreticileri büyük ölçüde bağlıdır zaman alıcı CFU sayma dahil, bakteriyel rekabet tahlil için sayısal bir yaklaşım geliştirilebileceğini vurguladı. P. gibi bir antibiyotiğe dirençli suşların halinde aeruginosa, bu yöntemlerin uygun olabilir. Ayrıca, 100'den fazla bakteriyel genom 14 yaklaşık 200 farklı T6SS loci kimlik ile, uygun bir tarama aracı son derece arzu edilen bir durumdur. Biz kullanımı kolaydır ve standart laboratuar malzeme ve reaktifler gerektirir bir test geliştirdi. Yöntem lacZ geninin bir tümleme-izin veren bir yem (Bu durumda, Escherichia coli DH5α) gibi bir raportör suşu kullanılarak T6SS-bağımlı bakteri öldürücü / bacteriostasis aktivitesini izlemek için bir hızlı ve nicel teknik sunmaktadır. Genel olarak, bu yöntem bir grapHIC ve agar plaklarına T6SS ilgili fenotipleri hızla tanınmasına olanak sağlar. Bu deneysel protokol dikkate bu gibi büyüme ortamı, sıcaklık ya da temas süresi olarak belirli koşullar alma diğer bakteriler ya da bakteri türleri için adapte edilebilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu makalede sunulan yöntem T6SS-aracılı bakterisidal / bacteriostasis eylemin görsel gözlem sağlar. Tahlil bir agar plaka yüzeyi üzerinde gerçekleştirilir. Daha önce karışık sıvı bakteri kültürü ile gerçekleştirilir T6SS-bağlı öldürme deneyi çünkü iki bakteri 8 arasında sürekli temas olmaması nedeniyle olası, etkili olmadığı gösterilmiştir. T6SS hedef hücreler 17 içine DNA enjekte etmek için bakteriyofaj tarafından kullanılan ile benzer bir mekanizma ile çalışır inanılmaktadır. Sıvı kültüründe T6SS ve tüp benzeri yapı daha kolay kırılabilir, inter-bakteriyel temas kaybetmiş olabilir ve toksinler verimli teslim edilmez.
Inkübasyon sürelerinde açısından, biz donör zorlanma ve avını arasındaki açıklayan temas 5 başlangıç saatleri P. arasındaki bakteri öldürme gözlemlemek yeterlidir aeruginosa, E. Şekil 3 'de gösterildiği coli </strong>. Bununla birlikte, bu deney koşulları optimize etmek için bir kinetik gerçekleştirilerek kuluçka zamanı ayarlamak için tavsiye edilir.
Bu yöntem, bir renk dayalı bir teknik olduğu için, çıkış sonuçları verici suşu pigmentasyon ile kısıtlanabilir. Örneğin, S. durumunda aeruginosa, bazı suşlar av gelen ayrım nispeten zor yapma, tahlil okuma engelleyebilir gibi pyocyanin ve pyoverdine gibi renkli pigmentler yüksek düzeyde üretmek. Böyle eflatun-gal veya kırmızı gal gibi diğer kromojenik β-galaktosidaz substratlar, X-gal (Tablo 1) yerine kullanılabilir.
Yarışma testi okuma için diğer muhabiri genleri yararlanabilirler. Örneğin, benzer bir deneyi de yeşil floresan protein etiketli avlayan 12 kullanılarak yapılmıştır.
Bizim tayini, nicel olmasa da, iyi bir fikir veriyorT6SS faaliyetin bu hayatta kalma ya da bir muhabir yırtıcı öldürülmesi dayalı olduğu. Bu teknik, basit ve herhangi bir bakteri türlerinin T6SSs bakterisidal / bacteriostasis aktivitesini değerlendirmek için uygun olma avantajını sağlar. Şimdiye kadar, T6SS faaliyeti Gram-negatif bakteri ve T6SS-duyarlı Gram-pozitif bakterilere ait herhangi bir karşı örneği gösterilmiştir 12 henüz rapor edilmiştir. Bu test etmek için çeşitli bakteri türleri üzerinde kültür uyumsuzluk (örneğin, büyüme sıcaklık, oksijen, belirli bir ortam) dikkate alınmalıdır olduğu da açıktır.
Tüm tahlil bir salgılanan toksin bile izleri av öldürmek için yeterli olabilir çünkü T6SS bileşenleri olan kesinlikle gereklidir değerlendirmek için de kullanılabilir. Kültür süpernatant ve western blot kullanarak standart bir prosedür testi T6SS bağımlı sekresyonunu göre T6SS bile zayıf aktivite sonra açıkça bizim tahlili ile tespit edilebiliranalizi. Bununla birlikte, uygun bir koloni oluşturan birim (CFU) sayım yine bu T6SS aktivitenin tayini için daha kesin gereklidir.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma Wellcome güven hibe WT091939MA tarafından finanse edildi. Alain Filloux Royal Society tarafından desteklenmektedir.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalogue Number | Comments |
| P. aeruginosa PAKΔretS (D+) (active T6SS) |
Lab strain | Described in Reference 16 | |
| P. aeruginosa PAKΔretSΔH1-T6SS (D–)(inactive T6SS) | This study | The H1-T6SS cluster (encompassing the genes PA0070 to PA0095) has been deleted by allelic exchange following the procedure described in Reference 18. The mutator fragment was generated with the following set of primers: The Up fragment primers: 5′-ATGGTCAACGACATGGAGCTGGAG-3′, and 5’CGAGGCCGATCAGGCCTTCAGAACTGA-3′. The Down fragment primers : 5′-TCAGGCCTTCAGAACTGAAGCGGCGCA-3′, 5'-GGTGGCGTTCAACAGTTCCATGTC-3' |
|
| E.coli DH5α | Invitrogen | 18258-012 | F- φ80lacZΔM15 Δ(lacZYA-argF) U169 recA1 endA1 hsdR17 (rk-, mk+) phoA supE44 λ- thi-1 gyrA96 relA1 |
| pBluescript II SK(+) | Agilent | 212205 | This vector expresses the α peptide of β-galactosidase used for α-complementation. |
| X-gal | Invitrogen | 15520-018 | Use at 40 μg/ml |
| Luria Bertani agar | Merck-chemicals | 1.10283.0500 | |
| TSB (casein soya bean broth) | Oxoid | CM109 | |
| Vortex shaker Genius 3 | IKA | 3340000 | |
| Scanner | Epson | V700 | |
| Spectrophotometer | WPA Biowave | CO8000 Cell Density Meter | |
| Magenta-gal | Bioworld | 30350001-1 (715241) | |
| Red-gal | Research organics | 1364c | |
Table 1. Strain, plasmid, material and reagent used. |
References
- Filloux, A., et al. The bacterial type VI secretion machine: yet another player for protein transport across membranes. Microbiology. 154 (6), 1570 (2008).
- Cascales, E., Cambillau, C. Structural biology of type VI secretion systems. Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 367 (1592), 1102 (2012).
- Leiman, P. G., et al. Morphogenesis of the T4 tail and tail fibers. Virol. J. 7, 355 (2010).
- Ballister, E. R., et al. In vitro self-assembly of tailorable nanotubes from a simple protein building block. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105 (10), 3733 (2008).
- Leiman, P. G., et al. Type VI secretion apparatus and phage tail-associated protein complexes share a common evolutionary origin. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106 (11), 4154 (2009).
- Pukatzki, S., et al. Type VI secretion system translocates a phage tail spike-like protein into target cells where it cross-links actin. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104 (39), 15508 (2007).
- Ma, A. T., et al. Translocation of a Vibrio cholerae type VI secretion effector requires bacterial endocytosis by host cells. Cell Host Microbe. 5 (3), 234 (2009).
- Hood, R. D., et al. A type VI secretion system of Pseudomonas aeruginosa targets a toxin to bacteria. Cell Host Microbe. 7 (1), 25 (2010).
- Russell, A. B., et al. Type VI secretion delivers bacteriolytic effectors to target cells. Nature. 475 (7356), 343 (2011).
- Li, M., et al. Structural basis for type VI secretion effector recognition by a cognate immunity protein. PLoS Pathog. 8 (4), e1002613 (2012).
- Zheng, J., et al. Genetic analysis of anti-amoebae and anti-bacterial activities of the type VI secretion system in Vibrio cholerae. PLoS One. 6 (8), (2011).
- Schwarz, S., et al. Burkholderia type VI secretion systems have distinct roles in eukaryotic and bacterial cell interactions. PLoS Pathog. 6 (8), e23876 (2010).
- Murdoch, S. L., et al. The opportunistic pathogen Serratia marcescens utilizes type VI secretion to target bacterial competitors. J. Bacteriol. 193 (21), 6057 (2011).
- Boyer, F., et al. Dissecting the bacterial type VI secretion system by a genome wide in silico analysis: what can be learned from available microbial genomic resources?. BMC Genomics. 10, 104 (2009).
- Maniatis, T., et al. . Molecular cloning: A Laboratory Manual. , (1982).
- Mougous, J. D., et al. A virulence locus of Pseudomonas aeruginosa encodes a protein secretion apparatus. Science. 312 (5779), 1526 (2006).
- Records, A. R., et al. The type VI secretion system: a multipurpose delivery system with a phage-like machinery. Mol. Plant Microbe Interact. 24 (7), 751 (2011).
- Hachani, A., et al. Type VI secretion system in Pseudomonas aeruginosa: secretion and multimerization of VgrG proteins. J. Biol. Chem. 286 (14), 12317 (2011).
