Assay חזותי לפקח תחרות קטריאלי T6SS בתיווך
Summary
אנו מתארים assay איכותי לפקח תחרות חיידקים מתווכת על ידי<em> Aeruginosa Pseudomonas</em> מערכת הפרשת הסוג שישי (T6SS). הבדיקה מסתמכת על ההישרדות / הרג של תאי מטרת coli Escherichia נושאים<em> LacZ</em>-כתב. טכניקה זו היא מתכווננת כדי להעריך את הפעילות / bacteriostasis bactericidal של מיקרואורגניזמים T6SS-מיומנים.
Abstract
מערכות הפרשת VI סוג ב '(T6SSs) הן נאנומכונות המולקולרית המאפשרת לחיידקים גראם שליליים, להובלה ולהזריק חלבונים לתוך מגוון רחב של 1,2 תאי המטרה. T6SS מורכב של 13 רכיבי ליבה ומציגה דמיון מבני עם זנב הצינור של bacteriophages 3. Phage משתמש צינור ומכשיר ניקוב לחדור את מעטפת התא של חיידקי היעד ולהזריק DNA. מוצע כי T6SS הוא מכשיר bacteriophage הפוך יצירת נתיב ספציפי במעטפת תא החיידק לנהוג effectors ורעלים אל פני השטח. התהליך יכול לקחת עוד יותר ומכשיר T6SS יכול לנקב תאים אחרים שבה החיידק נמצא במגע, ולכן הזרקת effectors ליעדים אלה. צינור הזנב וחלקי מכשיר התיקתוק של T6SS הם עשו עם חלבוני VgrG HCP ו, בהתאמה 4,5.
הרבגוניות של T6SS הודגמה דרך היםtudies באמצעות חיידקים פתוגנים שונים. את T6SS cholerae Vibrio יכול לשפץ את cytoskeleton של תאי מארח האיקריוטים ידי הזרקת VgrG "התפתח" נושא C-מסוף יקטין cross-linking תחום 6,7. עוד דוגמה בולטת תועדה לאחרונה באמצעות aeruginosa Pseudomonas שתוכל למקד ולהרוג חיידקים באופן T6SS תלוי, ולכן מקדם את הקמתה של חיידקים מיקרוביאליים בנישות ספציפיות וסביבה התחרותית 8,9,10.
במקרה האחרון, שלוש T6SS-מופרשים חלבונים, כלומר Tse1, Tse2 וTse3 זוהו כרעלים המוזרקים בחיידקי היעד (איור 1). התא התורם מוגן מפני השפעה המזיקה של effectors אלה דרך מנגנון אנטי רעל, בתיווך Tsi1, Tsi2 וTsi3 חלבוני החסינות 8,9,10. פעילות מיקרוביאלית זה יכול להיות במעקב כאשר חיידקי T6SS-מיומנים הם שיתוף טפח על היםolid משטחים בתחרות עם מיני חיידקים אחרים או עם חיידקי T6SS-לא פעילים מאותו המין 8,11,12,13.
הנתונים הזמינים הדגישו גישה מספרית לבדיקת תחרות חיידקים, כוללים ספירת CFU זמן רבה שתלויה במידה רבה על מקבלים אנטיביוטיים. במקרה של זנים עמידים בפני אנטיביוטיקות כמו פ aeruginosa, שיטות אלה יכולים להיות בלתי הולמים. יתר על כן, עם זיהוי של כ 200 לוקוסים T6SS שונים בלמעלה מ 100 הגנום של חיידקים 14, כלי מיון נוחים רצויים מאוד. פתחנו assay כי הוא קל לשימוש ואינו דורש חומרי מעבדה סטנדרטיים וחומרים כימיים. השיטה מציעה טכניקה מהירה ואיכותית כדי לפקח על פעילות T6SS התלוי bactericidal / bacteriostasis באמצעות לחץ כתב כטרף (במקרה זה חיידקי Escherichia DH5α) המאפשר-complementation של גן lacZ. בסך הכל, בשיטה זו היא ללפותיק ומאפשר זיהוי מהיר של פנוטיפים T6SS הקשורות בצלחות אגרו. פרוטוקול ניסוי, זה יכול להיות מותאם לזנים אחרים או מיני חיידקים תוך התחשבות בתנאים מסוימים, כגון תקשורת צמיחה, טמפרטורה או זמן של קשר.
Protocol
Representative Results
Discussion
השיטה שהוצגה במאמר זה מאפשרת תצפית חזותית של פעילות / bacteriostasis T6SS בתיווך bactericidal. הבדיקה מבוצעת על פני השטח של צלחת אגרה. זה כבר הראה בעבר כי assay ההרג T6SS תלוי הופיע עם תרבות חיידקי נוזל המעורבת הוא לא יעיל, סביר להניח בגלל חוסר קשר יציב בין שני החיידקים 8. T6SS הוא האמין פעולה עם מנגנון דומה לזו ששמשה את bacteriophages להזריק דנ"א לתוך תאי המטרה 17. בתרבות של נוזל, המבנה דמוי צינור של T6SS עלול להישבר בקלות רבה יותר, קשר בין החיידקים יכול ללכת לאיבוד, ואת הרעלים לא יעיל מועברים.
במונחים של זמני דגירה, 5 השעות הראשונות של קשר שאנו מתארים בין המתח התורם והטרף מספיקות כדי להתבונן הרג חיידקים בין פ aeruginosa וא coli, כמוצג באיור 3 </strong>. עם זאת, רצוי להתאים את זמן הדגירה על ידי ביצוע קינטית על מנת לייעל את תנאי הניסוי.
מאחר ושיטה זו היא טכניקת צבע מבוססת, תוצאות הפלט יכולים להיות בסכנה על ידי פיגמנטציה של זן התורם. לדוגמה, במקרה של פ aeruginosa, זנים מסוימים לייצר רמות גבוהות של פיגמנטים צבעוניים כגון pyocyanin וpyoverdine, אשר יכול להפריע לreadout assay, מה שהופך את ההבחנה מהטרף קשה יחסית. מצעים אחרים chromogenic β-גלקטוזידאז, כמו מגנט גל או גל אדום, יכולים לשמש במקום X-gal (טבלה 1).
Assay התחרות יכול לעשות שימוש בגנים מדווחים אחרים להודעה. לדוגמה, בדיקה דומה גם בוצעה באמצעות 12 פושט חלבון פלואורסצנטי ירוק שכותרתו.
הבדיקה שלנו, ואילו לא כמותית, נותנת אינדיקציה טובהפעילות T6SS מאחר שהוא מבוסס על ההישרדות או ההרג של טרף כתב. טכניקה זו מציגה את היתרון של להיות קל ונוח להערכת הפעילות / bacteriostasis bactericidal של T6SSs מכל מיני חיידקים. עד כה, הפעילות של T6SS הוכחה כנגד חיידקים גראם שליליים, ואין דוגמה מובהקת לחיידקי T6SS רגישים גראם חיוביים כבר דווח עדיין 12. זה גם ברור שאי התאמה בתרבות של מיני חיידקים השונים לבדיקה (למשל צמיחת טמפרטורה, חמצון, תקשורת הספציפית) היא להילקח בחשבון.
הבדיקה שלנו יכולה לשמש גם כדי להעריך איזה ממרכיבי T6SS הם חיוניים משום שגם עקבות של רעל מופרש עשויות להיות מספיק כדי להרוג את הטרף. גם פעילות חלשה של T6SS יכולה אז ברורה להיות מזוהית על ידי הבדיקה שלנו, בהשוואה להפרשה סטנדרטית הליך בדיקת T6SS תלוית תרבות באמצעות כתם supernatant והמערביניתוח. עם זאת, יחידת ספירה נכונה מושבת יוצרים (CFU) עדיין נדרשה לכימות מדויק של פעילות T6SS זה.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו מומנה על ידי קרן Wellcome מענק WT091939MA. אלן Filloux נתמך על ידי החברה המלכותית.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalogue Number | Comments |
| P. aeruginosa PAKΔretS (D+) (active T6SS) |
Lab strain | Described in Reference 16 | |
| P. aeruginosa PAKΔretSΔH1-T6SS (D–)(inactive T6SS) | This study | The H1-T6SS cluster (encompassing the genes PA0070 to PA0095) has been deleted by allelic exchange following the procedure described in Reference 18. The mutator fragment was generated with the following set of primers: The Up fragment primers: 5′-ATGGTCAACGACATGGAGCTGGAG-3′, and 5’CGAGGCCGATCAGGCCTTCAGAACTGA-3′. The Down fragment primers : 5′-TCAGGCCTTCAGAACTGAAGCGGCGCA-3′, 5'-GGTGGCGTTCAACAGTTCCATGTC-3' |
|
| E.coli DH5α | Invitrogen | 18258-012 | F- φ80lacZΔM15 Δ(lacZYA-argF) U169 recA1 endA1 hsdR17 (rk-, mk+) phoA supE44 λ- thi-1 gyrA96 relA1 |
| pBluescript II SK(+) | Agilent | 212205 | This vector expresses the α peptide of β-galactosidase used for α-complementation. |
| X-gal | Invitrogen | 15520-018 | Use at 40 μg/ml |
| Luria Bertani agar | Merck-chemicals | 1.10283.0500 | |
| TSB (casein soya bean broth) | Oxoid | CM109 | |
| Vortex shaker Genius 3 | IKA | 3340000 | |
| Scanner | Epson | V700 | |
| Spectrophotometer | WPA Biowave | CO8000 Cell Density Meter | |
| Magenta-gal | Bioworld | 30350001-1 (715241) | |
| Red-gal | Research organics | 1364c | |
Table 1. Strain, plasmid, material and reagent used. |
References
- Filloux, A., et al. The bacterial type VI secretion machine: yet another player for protein transport across membranes. Microbiology. 154 (6), 1570 (2008).
- Cascales, E., Cambillau, C. Structural biology of type VI secretion systems. Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 367 (1592), 1102 (2012).
- Leiman, P. G., et al. Morphogenesis of the T4 tail and tail fibers. Virol. J. 7, 355 (2010).
- Ballister, E. R., et al. In vitro self-assembly of tailorable nanotubes from a simple protein building block. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105 (10), 3733 (2008).
- Leiman, P. G., et al. Type VI secretion apparatus and phage tail-associated protein complexes share a common evolutionary origin. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106 (11), 4154 (2009).
- Pukatzki, S., et al. Type VI secretion system translocates a phage tail spike-like protein into target cells where it cross-links actin. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104 (39), 15508 (2007).
- Ma, A. T., et al. Translocation of a Vibrio cholerae type VI secretion effector requires bacterial endocytosis by host cells. Cell Host Microbe. 5 (3), 234 (2009).
- Hood, R. D., et al. A type VI secretion system of Pseudomonas aeruginosa targets a toxin to bacteria. Cell Host Microbe. 7 (1), 25 (2010).
- Russell, A. B., et al. Type VI secretion delivers bacteriolytic effectors to target cells. Nature. 475 (7356), 343 (2011).
- Li, M., et al. Structural basis for type VI secretion effector recognition by a cognate immunity protein. PLoS Pathog. 8 (4), e1002613 (2012).
- Zheng, J., et al. Genetic analysis of anti-amoebae and anti-bacterial activities of the type VI secretion system in Vibrio cholerae. PLoS One. 6 (8), (2011).
- Schwarz, S., et al. Burkholderia type VI secretion systems have distinct roles in eukaryotic and bacterial cell interactions. PLoS Pathog. 6 (8), e23876 (2010).
- Murdoch, S. L., et al. The opportunistic pathogen Serratia marcescens utilizes type VI secretion to target bacterial competitors. J. Bacteriol. 193 (21), 6057 (2011).
- Boyer, F., et al. Dissecting the bacterial type VI secretion system by a genome wide in silico analysis: what can be learned from available microbial genomic resources?. BMC Genomics. 10, 104 (2009).
- Maniatis, T., et al. . Molecular cloning: A Laboratory Manual. , (1982).
- Mougous, J. D., et al. A virulence locus of Pseudomonas aeruginosa encodes a protein secretion apparatus. Science. 312 (5779), 1526 (2006).
- Records, A. R., et al. The type VI secretion system: a multipurpose delivery system with a phage-like machinery. Mol. Plant Microbe Interact. 24 (7), 751 (2011).
- Hachani, A., et al. Type VI secretion system in Pseudomonas aeruginosa: secretion and multimerization of VgrG proteins. J. Biol. Chem. 286 (14), 12317 (2011).
