En Orthotopic musmodell av Anaplastisk thyroidcarcinoma

Ett. Cellberedning Fotnoter: 1) komplett RPMI1640 baserad kultur media recept (500 ml) innehåller 435 ml RPMI 1640, 50 ml värmeinaktiverad FBS, 5 ml icke-essentiella aminosyror, 5 ml natriumpyruvat, 5 ml antibiotika-antimykotika, 2) plats matrigel vid 4 ° C en dag före skörden av cellerna. Human ATC cellinje THJ-11T 8 odlas i 6 brunnar och skördas en gång 80-90% sammanflytande. Pelletera cellerna genom centrifugering vid 200 xg under 4 minuter vid rumstemperatur. Aspirera media och återsuspendera celler i RPMI 1640 media [2 ml / 6 brunnar]. Ta en liten volym av cellsuspensionen, lägga till den i en volym av 0,4% trypanblått och bestämma celldensitet med TC10 Automatiserad Cell Counter. Beräkna volymen av cellsuspension som behövs för att få 5 x 10 5 celler / mus gånger antalet möss injicera. Obs: För att säkerställa annons jämställa cell suspension för injektion, förbereda celler som om du injicerar dubbla antalet möss (t.ex. om att injicera 5 möss, sedan förbereda cellsuspension som om du injicera 10 möss). Överför behövs volym av cellsuspension i en 15 ml koniska rör. Pelletera cellerna genom centrifugering vid 200 xg under 4 minuter vid rumstemperatur. Aspirera media och återsuspendera celler i fullständigt RPMI 1640 media. Överför celler till ett 1,6 ml rör, tillsätt 1 volym matrigel och blanda försiktigt genom att långsamt pipettera in och ut. Obs: Varje mus kommer att få 10 pl av cellsuspensionen / matrigel cocktail. Sedan 5 x 10 5 celler suspenderade i en 10 pl injicerbara volym har med framgång använts i tidigare ATC orthotopic studier 9-10, använde vi dessa parametrar i denna rapport. Placera cellsuspensionen på is tills det ska användas. _title "> 2. Mouse Beredning Rengör kirurgiska området, vilket inkluderar dissekera omfattning och omgivningen, genom att torka alla ytor med 70% etanol. Slå på värmelampor / kuddar där djuren kommer att återhämta sig från operationen. Administrera 0,1 ml ketamin / xylazin (drog cocktail bestående av ketamin 9 mg / ml och xylazin 1mg/ml) per 10 g kroppsvikt intraperitonealt med användning av en 1 ml, 27G ½ "tuberkulinspruta. Prep musen för kirurgi: 1) rakning halsregionen av mus (från käklinjen till toppen av bröstbenet och ut till vapen), 2) skrubba kirurgiska området tre gånger med chorhexadine indränkt gasbinda rutor, 3) slutlig scrub gjort med betadin indränkt gasbinda, 4 ) försiktigt på ögonsalva för att förhindra att ögonen blir uttorkade. Kontrollera pedal reflex att säkerställa musen tillräckligt sövd. Placera djuret i rygg VILA på en disponibel sterilt område barriär under dissekera omfattning och säkra djuret på plats med tyg tejp. Scrubs händer och fingernails satte därefter på sterila kirurghandskar. I ett sterilt sätt, öppen kirurgi packa och arrangera instrument. Placera steril duk över djur, vilket innebär att endast operationsområdet exponeras. 3. Kirurgisk åtkomst till Sköldkörtel och cellinjektion Med en steril, engångs skalpell görs en 1-till-1,5 cm longitudinellt snitt längs mittlinjen av halsen. Obs: Avvikelse från mittlinjen komplicerar djupare skärning för att få tillgång till luftstrupen. Ganska exakt mittlinjesnitt kan du retas och skär genom membranösa vävnaden håller vänster och höger spottkörtlar ihop och minskar risken för hackning eller bryta stora artärer. Gör en andra snitt i bandet musklerna kring luftstrupen drar sedan den högra sidan av den snittade muskeln åt sidan för att exponera den högra sköldkörteln. Peanger kan användas vid denna punkt för att hålla muskeln lagret endelen för enkel åtkomst till sköldkörteln (Figur 1). Obs: Om alternativt förfarande som utförs av två kirurgiska personal, kan muskeln lagret helt enkelt hållas tillbaka med pincett medan en klar injektion spruta lämnas till kirurgen av biståndsmyndigheten personalen. Långsamt injicera 10 l cellsuspension in rätt sköldkörteln med en 31G 5/16 "insulin spruta sedan försiktigt bort nålen. 4. Avslutande av operationsområdet och mus Recovery Sutur muskel skikt med 6,0 ​​suturmaterial använder antingen en kontinuerlig eller avbruten suturering stil. Sy huden på samma sätt. Applicera ett lager av triple antibiotisk salva direkt över snittet webbplats. Låt djuret att återhämta sig i rygg VILA på värmedyna. När djuret kan uppnå sternala VILA utan hjälp, kan den placeras tillbaka med andra möss. <p class = "jove_title"> 5. Postoperativ övervakning och Tissue Collection Kontrollera snittet webbplatsen och allmänna hälsa av djuret dagligen under en vecka efter operationen, så kolla en gång i veckan. Om suturerna är fortfarande intakt efter 14 dagar, tas de bort. Obs: Djur som uppvisar tecken på sviktande hälsa (t.ex. betydande viktnedgång, Josh hår, ansträngd andning) bör avlivas och vävnader som samlats in. När möss har nått en förutbestämd postoperativ tid-punkten, administrera ketamin / xylazin som beskrivs ovan söva. BEGJUTA djur intracardially och skörd sköldkörtel / luftstrupe och andra vävnader av intresse (beskrivs inte närmare här).