Een orthotope Muis Model van Anaplastisch Schildklier Carcinoom

1. Cell Preparation Opmerkingen: 1) volledige RPMI 1640 gebaseerde voedingsbodems recept (500 ml) bevat 435 ml RPMI 1640, 50 ml hitte geïnactiveerd FBS, 5 ml niet-essentiële aminozuren, 5 ml natriumpyruvaat, 5 ml antibiotica-antimycotische; 2) plaats matrigel bij 4 ° C op een dag voorafgaand aan de cel oogst. Menselijke ATC cellijn THJ-11T 8 worden gekweekt in 6 putjes en een keer 80-90% samenvloeiing geoogst. Pellet cellen door centrifugatie bij 200 xg gedurende 4 minuten bij kamertemperatuur. Aspireren media en resuspendeer cellen in RPMI 1640 media [2 ml / 6 wells plaat]. Neem een ​​klein volume van de celsuspensie, toevoegen aan een volume van 0,4% trypan blauwe kleurstof en bepalen celdichtheid behulp TC10 geautomatiseerde cel Counter. Bereken volume celsuspensie nodig 5 x 10 5 cellen / muis maal het aantal muizen te injecteren. Opmerking: Om ervoor te zorgen advertentie gelijk cel suspensie voor injectie, bereiden cellen alsof je injecteren dubbele van het aantal muizen (bijvoorbeeld als het injecteren van 5 muizen, dan bereiden celsuspensie alsof u het injecteren van 10 muizen). Overdragen nodig volume van celsuspensie in een 15 ml conische buis. Pellet cellen door centrifugatie bij 200 xg gedurende 4 minuten bij kamertemperatuur. Aspireren media en resuspendeer cellen in volledige RPMI 1640 media. Overdracht van cellen om een ​​ml tube 1.6, voeg 1 volume matrigel en meng voorzichtig door langzaam pipetteren in en uit. Opmerking: Elke muis wordt 10 ul van de celsuspensie / Matrigel cocktail ontvangen. Aangezien 5 x 10 5 cellen gesuspendeerd in een 10 pl volume injecteerbare succes zijn gebruikt in eerdere studies ATC orthotope 9-10, gebruikten we de parameters in dit rapport. Plaats celsuspensie op ijs tot gebruik. _title ". Mouse> 2 Bereiding Reinig de chirurgische zone, die het ontleden scope en omgeving, door af te vegen alle oppervlakken met 70% ethanol bevat. Schakel warmtelampen / pads waar de dieren zullen worden herstellende van een operatie. Dien 0,1 ml ketamine / xylazine (combinatietherapie bestaande uit ketamine 9 mg / ml en xylazine 1mg/ml) per 10 g lichaamsgewicht intraperitoneaal met een 1 ml, 27G ½ "tuberculine spuit. Prep muis voor een operatie: 1) scheren halsgebied van de muis (van kaaklijn naar de top van het borstbeen en uit om de armen), 2) scrub chirurgische gebied drie keer met chorhexadine doordrenkte gaas pleinen, 3) definitief scrub gedaan met betadine doordrenkte gaas, 4 ) voorzichtig oogzalf gelden voor de ogen niet uitdroogt. Controleer pedaal reflex om ervoor te zorgen muis is voldoende verdoofd. Plaats dier in de rug gelegd op een disposable steriele veld barrière onder het ontleden scope en zet het dier op zijn plaats met een doek tape. Scrubs handen en voetingernails zet dan op steriele chirurgische handschoenen. In een steriele manier, open chirurgie inpakken en regelen instrumenten. Plaats steriel laken dan dierlijke, waardoor alleen operatiegebied blootgesteld. 3. Chirurgische toegang tot Schildklier en Cell Injection Met behulp van een steriele wegwerpspuit scalpel een 1 op 1,5 cm longitudinale incisie langs de middellijn van de keel. Opmerking: Afwijking van de middellijn bemoeilijkt dieper snijden om de luchtpijp. Vrij nauwkeurige middellijn incisie kunt u plagen en dwars door de membraneuze weefsel houden links en rechts speekselklieren samen en vermindert kans op knikken of versnijden grote slagaders. Maak een tweede incisie in de riem spieren rond de luchtpijp en trek de rechterkant van de ingesneden spier aan de zijkant om de juiste schildklier bloot. Hemostats kan op dit moment worden gebruikt om de spierlaag bezit zijn van eendeel voor gemakkelijke toegang tot de schildklier (figuur 1). Opmerking: Als alternatief, als de procedure uitgevoerd door twee chirurgische personeel, de spierlaag kan eenvoudig worden tegengehouden met een tang, terwijl een kant en klaar injecteerbare injectiespuit wordt overhandigd aan de chirurg door het assisterend personeel. Injecteer langzaam 10 pi celsuspensie in de juiste schildklier met een 31G 5/16 "insulinespuit dan naald verwijder voorzichtig. 4. Sluiting van Surgical Site en Muis Recovery Hechtdraad spierlaag met 6,0 hechtmateriaal volgens een continu of onderbroken hechten stijl. Steek de huid op dezelfde manier. Breng een laag drievoudige antibiotische zalf direct over incisieplaats. Laat dier te herstellen in dorsale decubitus op warme verwarming pad. Zodra dier sternale decubitus kan bereiken zonder hulp, kan worden terug met andere muizen geplaatst. <p class = "jove_title"> 5. Post-operatieve monitoring en Tissue Collection Controleer de incisie en de algehele gezondheid van het dier per dag gedurende een week na de operatie, controleer dan een keer per week. Als de hechtingen nog intact zijn na 14 dagen worden ze verwijderd. Opmerking: Dieren tekenen van afnemende gezondheid (bv. substantieel gewichtsverlies, smerig haar, moeizame ademhaling) moeten gedood worden en weefsels verzameld. Zodra muizen een vooraf bepaalde postoperatieve tijd-punt hebben bereikt, beheren ketamine / xylazine zoals hierboven beschreven te verdoven. Perfuseren dier intracardiaal en oogst schildklier / luchtpijp en andere weefsels van belang (niet in detail beschreven).