Métodos experimentales para probar los efectos del péptido neurotrófico, ADNF-9, contra la apoptosis inducida por el alcohol durante el embarazo en C57BL / 6 ratones
Summary
Los diseños experimentales que aquí se proponen centrarse en el estudio de los efectos de la exposición al alcohol en la apoptosis y la aplicación de péptido neurotrófico durante el embarazo en el cerebro fetal. Se describe una descripción detallada de la cría a la colección de cerebros fetales. Las técnicas para la determinación de la apoptosis también se describen en detalle.
Abstract
Diseños experimentales para la investigación de los efectos de la exposición prenatal al alcohol durante las etapas embrionarias tempranas en el desarrollo del cerebro fetal son desafiantes. Esto es debido a la dificultad de microdisección de los cerebros fetales y su corte por secciones Para la determinación de las células apoptóticas causadas por la exposición prenatal al alcohol en su mayoría. Los experimentos descritos aquí proporcionar técnicas visualizados a partir de ratones de cría para la identificación de la muerte celular en el tejido cerebral fetal. Este estudio utilizó ratones C57BL / 6 como el modelo animal para el estudio de la exposición al alcohol fetal y el papel de péptido trófico contra la apoptosis inducida por el alcohol. La cría se compone de una ventana de la estera de 2 horas para determinar el grado exacto de la edad embrionaria. Un modelo de la exposición al alcohol fetal establecido se ha utilizado en este estudio para determinar los efectos de la exposición prenatal al alcohol en el cerebro del feto. Esto implica el libre acceso a las dietas líquidas alcohol o par-alimentados como única fuente de nutrientes para los ratones embarazadas.
<p class = "jove_content"> Las técnicas que implican la disección de los fetos y de microdisección de los cerebros fetales se describen cuidadosamente, ya que este último puede ser un reto. Microdissection requiere un microscopio estereoscópico y fórceps ultrafinas. Procedimientos paso a paso para la disección de los cerebros fetales se proporcionan visualmente. Los cerebros fetales se disecan a partir de la base del bulbo olfatorio primordio a la base de la metencéfalo.Para investigar la apoptosis, los cerebros fetales están integrados por primera vez en la gelatina con un desprendimiento del molde para facilitar su seccionamiento con un aparato vibratome. Cerebros fetales incrustados y fijados en paraformaldehído son fácilmente seccionada, y las secciones flotantes libres pueden ser montados en portaobjetos Superfrost Plus para la determinación de la apoptosis o muerte celular.
TUNEL (TdT-mediada por dUTP nick fin de etiquetado; TdT: desoxinucleotidil transferasa terminal) de ensayo ha sido utilizado para identificar la muerte celular o apoptosis. Es de destacar que apoptosis y la citotoxicidad mediada por células se caracterizan por la fragmentación del ADN. Por lo tanto, las células TUNEL-positivas visualizados son indicativos de la muerte celular o apoptosis.
Los diseños experimentales aquí proporcionan información sobre el uso de una dieta líquida establecido para el estudio de los efectos del alcohol y el papel de los péptidos neurotróficos durante el embarazo en los cerebros fetales. Se trata de la cría y la alimentación de los ratones embarazadas, microdissecting cerebros fetales, y la determinación de la apoptosis. En conjunto, estas técnicas visuales y de texto pueden ser una fuente para la investigación de la exposición prenatal de agentes nocivos en el cerebro del feto.
Introduction
El objetivo de los métodos experimentales descritos aquí es para evaluar los efectos neuroprotectores de los péptidos tróficos en un modelo de exposición de alcoholismo fetal utilizando varias técnicas que incluyen la cría, alimentación, microdissecting, y la detección de la muerte celular. El trabajo de nuestro laboratorio ha supuesto una dieta líquida mezclada con alcohol como un modelo de consumo moderado de alcohol, que puede ser similar a un paradigma de consumo humano en términos de la cantidad de alcohol consumida 1-5. Nosotros y otros han identificado tres derivados de péptidos que son neuroprotector frente a los efectos nocivos de la exposición fetal al alcohol. Estudios de investigación de la exposición al alcohol durante las etapas embrionarias en modelos animales pueden conducir a la identificación de los posibles mecanismos de neuroprotección y permitir el desarrollo de los procedimientos de intervención. Esto puede proporcionar una información amplia sobre los efectos neuroprotectores y de atenuación de los efectos nocivos de la exposición al alcohol durante el embarazo.
Posible prevención de los efectos de la exposición prenatal al alcohol puede implicar el tratamiento de ratones hembra embarazadas con péptidos que han demostrado estar involucrados en la neuroprotección in vitro e in vivo 6,7 1,2,4,8,9. Entre estos péptidos, SALLRSIPA, conocido como ADNF-9 o SAL, se deriva de la actividad dependiente de factor neurotrófico (ADNF) 7,10. Otro péptido con la secuencia de péptido NAPVSIPQ, denominado NAP, deriva de la proteína dependiente de la actividad neuroprotectora (ADNP) 6,11, demostrado un potente efecto protector contra el estrés oxidativo asociado con la exposición al alcohol 12,13. Además, recientemente hemos identificado un nuevo péptido sintetizado, colivelin que parece desempeñar un papel clave neuroprotector en el modelo de exposición fetal al alcohol 2. Colivelin se compone de ADNF-9 y AGA-(C8R) HNG17 (PAGASRLLLLTGEIDLP). La importancia de la utilización de estos péptidos es que tienen la capacidad decruzar la barrera sangre-cerebro para prevenir los efectos de la apoptosis inducida por el alcohol y el déficit de crecimiento del cerebro.
Los métodos experimentales utilizaron ratones C57BL / 6 para probar los efectos neuroprotectores contra la apoptosis inducida por el alcohol. Hemos adoptado una ventana en lugar de cría durante la noche de 2 horas con el fin de calcular con exactitud el día embrionario 0 (E0), ya que puede ser revelado por la detección de un tapón de esperma y una citología vaginal 1-5. Hemos utilizado una dieta líquida con tubos de alimentación, ya que se considera libre acceso en lugar de la entrega de alcohol por vía sonda, que puede inducir estrés ratonas preñadas. Por otro lado, microdisección puede ser un reto debido a la suavidad del tejido cerebral fetal, que se podría encontrar cuando la disección de los cerebros fetales en las etapas embrionarias tempranas. Aquí, mostramos las técnicas visualizados para hacer frente a todos los desafíos que implican microdisección. Además, como el seccionamiento del cerebro fetal también puede ser un reto, hemos adoptadouna técnica que consiste en incrustar el cerebro del feto en gelatina con desprendimiento incrustar moldes. Hemos tenido éxito en la reducción de los cerebros fetales en las secciones flotantes a 50 m de espesor. Esto nos permite investigar cualquier alteración del contenido de proteínas en las secciones del cerebro fetal, incluida la determinación de la muerte celular.
Protocol
Representative Results
Discussion
La metodología y tecnología presentada en este estudio demuestran los efectos de la exposición prenatal al alcohol en los cerebros fetales y el papel de los péptidos tróficos en la prevención de estos efectos. Estos pueden proporcionar información sobre la forma de estudiar otras drogas de abuso u otros productos químicos tóxicos en el cerebro del feto durante las diferentes etapas del embarazo.
En lo que respecta a la paradigma de cría, en algunos casos podría no ser observable l…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este proyecto de investigación fue apoyada por el premio número R21AA017735 (YS) de los Institutos Nacional de Abuso de Alcohol y Alcoholismo. El contenido es de exclusiva responsabilidad del autor y no representa necesariamente las opiniones oficiales del Instituto Nacional sobre el Abuso de Alcohol y Alcoholismo o los Institutos Nacionales de Salud. El autor también desea agradecer a Charisse Montgomery para la edición de este manuscrito.
Materials
| Name of the reagent/equipment | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Superfrost Plus Slides | VWR | 48311-703 | |
| PAP PEN | Research Products Int. Corp. | 195506 | |
| 5-Plend Open Mailer | Heathrow Scientific, LLC | HS 15983G | |
| Peel away embedding molds | Electron Microscopy Sciences | 70182 | |
| In situ cell death detection kit, POD | Roche Diagnostics, Inc | 11684817910 | |
| Hanks’ Balanced Salt Solution | Invitrogen | 14170-120 | |
| Gelatin Type A | FisherScientific | G8-500 | |
| Stereomicroscope | W. NUHSBAUM, Inc | Leica M60, KL 200 LED | |
| Micro-Vibratome | Leica, Inc | Leica VT 1000S | |
| Moria Ultra Fine Forceps | Fine Science Tools | 11370-40 | 2 pairs |
| Graduate 30 ml feeding tubes | Dyets, Inc | 900012 | |
| Vitamin Mix | Bio-Serv. Inc. | F8031 | |
| Mineral Mix | Bio-Serv. Inc. | F8598 | |
| Maltose Dextrin | Bio-Serv. Inc. | 3650 | |
| Ethyl alcohol 190 Proof, 5 gallons | 111000190-SS05 | Pharmco-AAPER | |
| Upright microscope | W. NUHSBAUM, Inc | LEICA DM 4000 |
References
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