T 세포의 실시간 라이브 영상은 복잡한 형성을 신호
Summary
우리는 T 세포 활성화 과정 중에 단백질 역학에 대한 통찰력을 제공하는 라이브 세포 이미징 방법을 설명합니다. 우리는 정량적 인 결과는 T 세포 활성화에 걸쳐 복잡한 형성 신호를 따라 열매를 산출하는 T 세포의 확산 분석, 공 촛점 현미경 및 이미징 분석의 결합 사용을 보여줍니다.
Abstract
전염성 질병에 대한 보호는 면역 시스템 1,2에 의해 중재된다. T 림프구는 여러 면역 세포 3,4의 활성화와 반응을 조절, 면역 시스템의 마스터 코디네이터입니다. T-세포의 활성화는 항원 제시 세포 (APC를)에 의해 표시되는 특정 항원의 인식에 따라 달라집니다. T 세포 항원 수용체 (TCR)는 각 T 세포 클론에 특정한 항원 특이성 5를 결정합니다. 항원에 TCR의 바인딩은 TCR 복합 구성 요소의 인산화를 유도합니다. T 세포 활성화를 촉진하기 위해이 신호는 같은 TCR에 신호 단백질의 모집 등 다양한 중요한 응답을 시작, 막의 세포질과 핵 형질해야하며 APC 사이트 (면역 시냅스), 자신의 분자 활성화, 골격 재 배열, 세포 내 칼슘 농도의 상승, 유전자 발현 6,7의 변화. 에서 올바른활성화 신호의 itiation 및 종료 적절한 T 세포 반응을 위해 매우 중요합니다. 신호 단백질의 활동은 단백질 – 단백질 상호 작용의 형성과 종료에 따라 달라집니다, 이러한 단백질 인산화 단백질 복합체, 단백질의 ubiquitylation 다양한 휴대 사이트 8 단백질의 모집 형성으로 번역 수정을 게시 할 수 있습니다. T-세포 활성화 과정의 내부 동작을 이해하는 것은 면역 학적 연구와 임상 응용 프로그램 모두에 매우 중요합니다.
다양한 분석은 단백질 – 단백질 상호 작용을 조사하기 위해 개발되었습니다, 그러나, 널리 사용되는 공동 immunoprecipitation의 방법으로 생화학 적 분석은, 따라서 세포의 역학에 대한 귀중한 통찰력의 관찰을 배제, 단백질의 위치가 식별 될 수 없습니다 메커니즘. 또한 이러한 대량 분석은 일반적으로 t의 다른 단계에있을 수있는 많은 다른 세포에서 단백질을 결합그는 세포 프로세스를 조사 하였다. 이 시간 해상도에 해로운 영향을 미칠 수 있습니다. 살아있는 세포의 실시간 영상의 사용은 따라서 공정 9,10의 역학에 빛을 흘리는, 단백질의 공간적 추적 및 시간적 신호 이벤트를 구별 할 수있는 능력을 모두 할 수 있습니다. 우리는 T 세포 활성화 중에 신호 복잡한 형성의 실시간 영상의 방법을 제시한다. 기본 T 세포 또는 인 Jurkat 같은 T – 세포 라인, 비 생리적 인 올리고머 11을 방지 단량체 형광 단백질에 융합 관심의 단백질에 대한 인코딩 플라스미드 형질 전환됩니다. 라이브 T 세포는 특정 활성화 항원에 대한 필요성을 극복하면서 T 세포의 활성화를 유도 CD3/TCR 복합체에 결합 T-세포 활성화 항체 8,9와 coverslip을 미리 코팅을 통해 삭제됩니다. 활성화 된 세포는 지속적으로 공 촛점 현미경의 사용으로 몇 군데 있습니다. 영상 데이터는 COL과 같은 정량적 인 결과를 산출하기 위해 분석신호 단백질의 ocalization 계수.
Protocol
Representative Results
Discussion
여러 세포 프로세스의 규제 기능은 단백질 – 단백질 상호 작용의 형성 및 종료에 따라 달라집니다. 현미경 영상은 살아있는 세포에서 찬란 태그 단백질의 실시간 추적을 할 수 있습니다. 태그 단백질의 colocalization을이 단백질 사이의 직접 또는 간접적으로 상호 작용을 제안 할 수 있습니다, 그리고 면역 침전 등의 생화학 적 방법에 의해 얻어진 결과를 강화하는 데 사용할 수 있습니다. 생화학 적 ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자는 기술 지원 소피아 튀김 감사합니다. 보조금 no.1659/08, 971 / 08, 1503년부터 1508년까지 및 10분의 491, 아니 보조금 보건 및 과학의 사역에 대한 이스라엘 과학 재단 : MBS는 자신의 연구 지원을 위해 다음과 같은 기관을 감사드립니다. 3-4114과 3-6540, 후반 알렉산더 Smidoda의 부동산을 통해 이스라엘 암 협회와 바이오 의약품의 우수성 부여에 대한 Taubenblatt 패밀리 재단.
Materials
| Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| Amaxa human T Cell nucleofector kit | Lonza | VCA-1002 | |
| Anti CD3 (UCHT1 clone) | BioLegend | 300432 | |
| Falcon FACS Tubes | Becton Dickinson | 352058 | |
| FCS | HyClone | SV30160.03 | |
| G418 | Calbiochem | 345810 | |
| German coverglass system 4 chamber slides | Lab-Tek II | 155382 | |
| HCl | Bio Lab | 8410501 | |
| Hepes | Biological Industries | 03-025-1B | |
| Hygromycin | Enzo | ALX-380-306 | |
| L-glutamine | Sigma | G7513 | |
| PBS (10X) | Sigma | D1408 | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma | P0781 | |
| Poly-L-lysine 0.1% (w/v) in H2O | Sigma | P8920 | |
| RPMI | Sigma | R8758 | |
| Sodium azide | Sigma | S2002 | |
| Equipment | |||
| Accublock digital dry bath | Labnet | D1105A | |
| Centrifuge | Eppendorf | Centrifuge 5810 R | |
| Confocal microscope | Zeiss | LSM 510 Meta | |
| Heatable mounting frame – Heating Insert P S | PeCon | 130-800-031 | |
| TempModule S (required for the heatable mounting frame) | Zeiss | 411860-9010-000 | |
| Electroporation device | Amaxa | Nucleofector I | |
| Fluorescence activated cell sorter | Becton Dickinson | FACSVantage SE | |
| Image analysis software | Bitplane | 7.0.0 |
References
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