المكورات العنقودية الذهبية النمو باستخدام الهيموجلوبين الإنسان باعتبارها المصدر الحديد
Summary
نحن هنا وصف لفحص النمو<em> المكورات العنقودية الذهبية</em> باستخدام الهيموجلوبين كمصدر وحيد للحديد المغذيات المتاحة. هذا الاختبار يحدد دور العوامل البكتيرية المشاركة في الهيموغلوبين المستمدة من اكتساب الحديد.
Abstract
S. المذهبة هي نوع من البكتيريا المسببة للأمراض التي تتطلب الحديد لتنفيذ وظائف الأيض الحيوية وتسبب المرض. الخزان الأكثر وفرة من الحديد داخل الإنسان هو المضيف الهيم، والذي هو العامل المساعد من الهيموغلوبين. للحصول على الحديد من الهيموجلوبين، S. المكورات يستخدم نظام محكم المعروفة باسم المحدد سطح الحديد التنظيم (ISD) نظام 1. مكونات أول نظام ISD ربط الهيموغلوبين المضيف، ثم استخراج واستيراد الهيم، وأخيرا تحرير الحديد من الهيم في السيتوبلازم البكتيري 2،3. وقد تم تشريح هذا المسار من خلال العديد من الدراسات في المختبر 4-9. علاوة على ذلك، كانت مساهمة نظام ISD للإصابة أظهرت مرارا وتكرارا في نماذج الماوس 8،10-14. إنشاء مساهمة منظومة ISD إلى الهيموغلوبين المستمدة من اقتناء الحديد والنمو وقد ثبت أن تكون أكثر تحديا. معقدة المقايسات النمو باستخدام الهيموجلوبين كمصدر وحيد الحديد بY عدم استقرار الهيموجلوبين المتاحة تجاريا، وتلوث الحديد حرة في المتوسط النمو، وسمية المرتبطة chelators الحديد. هنا نقدم طريقة التي يتغلب هذه القيود. مستعدة عالية الجودة من الهيموغلوبين في الدم الطازجة ويتم تخزينها في النيتروجين السائل. وتستكمل الهيموغلوبين في تنقية الحديد تستنفد المتوسطة محاكاة البيئة الحديد للفقراء التي تواجهها مسببات الأمراض داخل المضيف الفقاريات. عن طريق تجويع S. المكورات من الحديد حرة والمكمل مع نموذج التلاعب الحد الأدنى من الهيموغلوبين نحن لحث على النمو بطريقة تعتمد اعتمادا كليا على القدرة على ربط الهيموغلوبين، واستخراج الهيم، من خلال تمرير الهيم المغلف الخلية البكتيرية وتتحلل الهيم في السيتوبلازم. وسوف يكون هذا الاختبار مفيدا للباحثين تسعى إلى إلقاء الضوء على آليات اكتساب الحديد في hemoglobin-/heme-derived S. المكورات وربما غيرها من مسببات الأمراض البكتيرية.
Protocol
Representative Results
Discussion
الحديد من المغذيات الأساسية اللازمة للكائنات من جميع ممالك الحياة 15. في الفقاريات، وعزلها الحديد لتجنب السمية الناجمة عن هذا العنصر. هذا تنحية يخفي أيضا من غزو الميكروبات الحديد في عملية تعرف باسم الحصانة الغذائية 16. وردا على ذلك تطورت مسببات الأمراض الا…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا البحث من قبل الولايات المتحدة المنح العامة للخدمات الصحية وAI69233 AI073843 من المعهد الوطني للحساسية والأمراض المعدية. EPS هو زميل ويلكوم بوروز في التسبب في الأمراض المعدية. وقد تم تمويل KPH من قبل الأحياء الدقيقة الجزيئية الخلوية والتدريب منحة البرنامج 5 T32 A107611-10.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalogue Number | Comments |
| HPLC anion exchange column | Varian | PL1551-3802 | |
| Drabkin’s reagent | Sigma | D5941-6VL | |
| Hemoglobin standard | Pointe Scientific | H7506-STD | |
| RPMI | HyClone | SH30011.02 | |
| Chelex 100 sodium form | Sigma | C7901 | |
| EDDHA | LGC Standards GmbH | ANC 001 | |
| Hemoglobin a antibody | Santa Cruz Biotechnology, Inc | SC-21005 | |
| Tryptic soy agar | BD | 236920 |
References
- Mazmanian, S., et al. Passage of heme-iron across the envelope of Staphylococcus aureus. Science. 299, 906-909 (2003).
- Pishchany, G., Skaar, E. P. Taste for blood: hemoglobin as a nutrient source for pathogens. PLOS Pathogens. 8, e1002535 (2012).
- Haley, K. P., Skaar, E. P. A battle for iron: host sequestration and Staphylococcus aureus acquisition. Microbes and infection. Institut Pasteur. 14, 217-227 (2012).
- Krishna Kumar, K., et al. Structural basis for hemoglobin capture by Staphylococcus aureus cell-surface protein. IsdH. The Journal of biological chemistry. 286, 38439-38447 (2011).
- Grigg, J. C., Mao, C. X., Murphy, M. E. Iron-coordinating tyrosine is a key determinant of NEAT domain heme transfer. Journal of Molecular Biology. 413, 684-698 (2011).
- Villareal, V. A., et al. Transient weak protein-protein complexes transfer heme across the cell wall of Staphylococcus aureus. Journal of the American Chemical Society. 133, 14176-14179 (2011).
- Muryoi, N., et al. Demonstration of the iron-regulated surface determinant (Isd) heme transfer pathway in Staphylococcus aureus. J. Biol. Chem. 283, 28125-28136 (2008).
- Reniere, M. L., Skaar, E. P. Staphylococcus aureus haem oxygenases are differentially regulated by iron and haem. Mol. Microbiol. 69, 1304-1315 (2008).
- Liu, M., et al. Direct hemin transfer from IsdA to IsdC in the iron-regulated surface determinant (Isd) heme acquisition system of Staphylococcus aureus. J. Biol. Chem. 283, 6668-6676 (2008).
- Pishchany, G., et al. Specificity for human hemoglobin enhances Staphylococcus aureus infection. Cell Host Microbe. 8, 544-550 (2010).
- Pishchany, G., Dickey, S. E., Skaar, E. P. Subcellular localization of the Staphylococcus aureus heme iron transport components IsdA and IsdB. Infect. Immun. 77, 2624-2634 (2009).
- Torres, V. J., Pishchany, G., Humayun, M., Schneewind, O., Skaar, E. P. Staphylococcus aureus IsdB is a hemoglobin receptor required for heme iron utilization. J. Bacteriol. 188, 8421-8429 (2006).
- Kim, H. K., et al. IsdA and IsdB antibodies protect mice against Staphylococcus aureus abscess formation and lethal challenge. Vaccine. 28, 6382-6392 (2010).
- Cheng, A. G., et al. Genetic requirements for Staphylococcus aureus abscess formation and persistence in host tissues. Faseb J. 23, 3393-3404 (2009).
- Andreini, C., Bertini, I., Cavallaro, G., Holliday, G. L., Thornton, J. M. Metal ions in biological catalysis: from enzyme databases to general principles. J. Biol. Inorg. Chem. 13, 1205-1218 (2008).
- Weinberg, E. D. Iron availability and infection. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – General Subjects. 1790, 600-605 (2009).
- Drabkin, D. Metabolism of the Hemin Chromoproteins. Physiological Reviews. 31, 345-431 (1951).
- Graversen, J. H., Madsen, M., Moestrup, S. K. CD163: a signal receptor scavenging haptoglobin-hemoglobin complexes from plasma. The international journal of biochemistry & cell biology. 34, 309-314 (2002).
- Torres, V. J., et al. Staphylococcus aureus Fur regulates the expression of virulence factors that contribute to the pathogenesis of pneumonia. Infect. Immun. 78, 1618-1628 (2010).
- Hammer, N. D., Skaar, E. P. Molecular Mechanisms of Staphylococcus aureus Iron Acquisition. Annu. Rev. Microbiol. , (2011).
- Hurd, A. F., et al. The iron-regulated surface proteins IsdA, IsdB, and IsdH are not required for heme iron utilization in Staphylococcus aureus. Fems. Microbiology Letters. 329, 93-100 (2012).
- Boys, B. L., Kuprowski, M. C., Konermann, L. Symmetric behavior of hemoglobin alpha- and beta- subunits during acid-induced denaturation observed by electrospray mass spectrometry. 生物化学. 46, 10675-10684 (2007).
- Williams, R. C., Tsay, K. Y. A convenient chromatographic method for the preparation of human hemoglobin. Analytical Biochemistry. 54, 137-145 (1973).
- Shen, T. J., et al. Production of unmodified human adult hemoglobin in Escherichia coli. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90, 8108-8112 (1993).
- Manjula, B. N., Acharya, S. A. Purification and molecular analysis of hemoglobin by high-performance liquid chromatography. Methods Mol. Med. 82, 31-47 (2003).
- Neilands, J. B. Microbial envelope proteins related to iron. Annual review of microbiology. 36, 285-309 (1982).
- Chart, H., Buck, M., Stevenson, P., Griffiths, E. Iron regulated outer membrane proteins of Escherichia coli: variations in expression due to the chelator used to restrict the availability of iron. Journal of General Microbiology. 132, 1373-1378 (1986).
- Rogers, H. J. Iron-Binding Catechols and Virulence in Escherichia coli. Infection and Immunity. 7, 445-456 (1973).
