Le dosage de dommages de l'ADN dans les neurones hippocampiques Utilisation de l'essai de comète
Summary
Le test des comètes est un moyen efficace de détection de ruptures simple et double brin, y compris alcali-labiles sites et DNA-DNA/DNA-protein liens croisés sur l'ADN dans toutes les cellules, y compris les neurones hippocampiques. La méthode tire parti de la migration différentielle de l'ADN dans un champ électrique dû à des différences de quantité de dommages de l'ADN.
Abstract
Un certain nombre de médicaments ciblent les voies de réparation de l'ADN et induire des cellules tuer en créant des lésions de l'ADN. Ainsi, des procédés pour mesurer directement lésions de l'ADN ont été largement évalués. Les méthodes traditionnelles sont longs, coûteux, et nécessitent beaucoup de ressources de réplication des cellules. En revanche, le test des comètes, un essai de cellule unique électrophorèse sur gel, est plus rapide, non invasif, peu coûteux, mesure directe et sensible de dommages à l'ADN et la réparation. Toutes les formes de dommages à l'ADN ainsi que réparation de l'ADN peut être visualisé au niveau de la cellule unique à l'aide de cette technique puissante.
Le principe qui sous-tend le test des comètes est que l'ADN intact est très ordonnée alors dommages à l'ADN perturbe cette organisation. Les suintements d'ADN endommagés dans la matrice d'agarose et lorsqu'il est soumis à un champ électrique, l'ADN chargé négativement migre vers la cathode qui est chargée positivement. Les brins d'ADN endommagés grands ne sont pas en mesure de migrer loin du noyau. Dommages à l'ADNcrée des fragments d'ADN plus petits qui voyagent plus loin que l'ADN intact. Comet Assay, un logiciel d'analyse d'images, mesures et compare l'intensité globale fluorescent de l'ADN dans le noyau avec l'ADN qui a migré hors du noyau. Signal fluorescent de l'ADN migré est proportionnelle à endommager l'ADN. ADN queue plus claire signifie lésions de l'ADN accrue. Certains des paramètres qui sont mesurés sont actuellement queue qui est à la fois une mesure de la quantité d'ADN et de la distribution de l'ADN dans la queue de longueur de queue, et le pourcentage d'ADN dans la queue. Ce test permet de mesurer réparation de l'ADN ainsi car la résolution des lésions de l'ADN signifie la réparation a eu lieu. La limite de sensibilité est d'environ 50 cassures par 1,2 cellule diploïde mammalien. Les cellules traitées avec des agents endommageant l'ADN, tels que l'étoposide, peut être utilisé en tant que contrôle positif. Ainsi, le test des comètes est une procédure rapide et efficace pour mesurer dommages à l'ADN.
Protocol
Discussion
Le test des comètes a la capacité unique d'analyse de cellules individuelles. Ceci est avantageux pour l'identification des sous-populations de cellules qui démontrent une réponse différentielle aux agents cytotoxiques. A quelques limitations pratiques doivent être prises en compte. Le nombre de cellules qui peuvent être évalués individuellement peuvent varier selon les individus. La taille de l'échantillon doit être augmenté s'il ya variation des dommages à l'ADN dans une population. Vi…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par le prix IMPACT du Département de radio-oncologie de l'Université d'Alabama-Birmingham Comprehensive Cancer Center, la Fondation du cancer de l'enfance de combat, et l'Ange Gabrielle Fondation (à ESY.).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalog number | Comments (optional) |
| 1.5 ml tubes | Santa Cruz Biotechnology, Inc | Sc-200271 | |
| 10X TBE (Tris base, boric acid, EDTA) | Fisher Scientific | BP13331 | |
| 15 ml tube | Fisher Scientific | 0553851 | |
| Agarose | Sigma | A5093 | |
| Aluminum foil | Fisher Scientific | 01213101 | |
| Beaker | Fisher Scientific | FB102300 | |
| Centrifuge | Thermo Scientific | 75004261PR | |
| Comet Assay software | Comet Assay IV Image Analysis System | ||
| Cylinder | Fisher Scientific | 08555F | |
| EDTA | GIBCO | 15575 | |
| Electrophoresis chamber | Thermo Scientific | 09528101 | |
| Ethanol | Fisher Scientific | A407P4 | |
| Fluorescent microscope | Zeiss Axio Vision | Any fluorescent microscope with green filter will suffice | |
| Hemacytometer | Fisher Scientific | 0267152 | |
| Low melting point agarose | Promega | V2111 | |
| Microwave | Sears | ||
| Phosphate buffered saline, calcium free, magnesium free | HyClone | SH3025601 | |
| Power supply | BioRad | 1645050 | |
| Refrigerator | Sears | ||
| Ruler | Staples | ||
| Slide | Fisher Scientific | 12550143 | |
| Sodium chloride | Sigma | S7653 | |
| Sodium hydroxide | Sigma | S5881 | |
| Sodium lauryl sarcosinate | Fisher Scientific | S529 | |
| Sybr green | Invitrogen | S7585 | |
| Tray | Fisher Scientific | 15242B | |
| Tris Base | Sigma | T6066 | |
| Triton-X 100 | Sigma | T8787 | |
| Trypsin | HyClone | SH3023601 | |
| Vortex | Fisher Scientific | 02216108 | |
| Water bath | Fisher Scientific | 154622Q |
References
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