יישום מקומי של תרופות לללמוד לתפקד קולטן אצטילכולין ניקוטינית בפרוסות מוח עכבר
Summary
במאמר זה, אנו מתארים שיטה יעילה ללמוד לתפקד ערוץ יון יגנד מגודר בנוירונים של פרוסות מוח מבודד בחריפות. שיטה זו כרוכה בשימוש בתרופה micropipette מלא ליישום מקומי של תרופות לתאי עצב שנרשמו באמצעות טכניקות מהדקות תיקון סטנדרטיות.
Abstract
שימוש בטבק מוביל לבעיות בריאותיות רבות, כולל סרטן, מחלות לב, אמפיזמה, ושבץ. התמכרות לעישון סיגריות היא הפרעה נפוצה נוירופסיכיאטריות שנובעת מפעולות biophysical והסלולריות של ניקוטין על קולטני אצטילכולין ניאציניות (nAChRs) ברחבי מערכת העצבים המרכזית. ההבנה תת nAChR השונה שקיימת באזורי המוח רלוונטיים להתמכרות לניקוטין היא בעדיפות עליונה.
ניסויים המשתמשים בשיטות electrophysiology כגון מהדק תיקון כל תאים או הקלטות מהדק מתח 2 ואלקטרודות שימושיים לאפיון תרופתי של nAChRs של עניין. תאים המבטא nAChRs, כגון תאי יונקי רקמות תרבות או ביציות Xenopus laevis, מבודד מבחינה פיזית ולכן הם למדו בקלות להשתמש בכלים של פרמקולוגיה המודרנית. התקדמות הרבה כבר נעשתה שימוש בטכניקות אלה, במיוחד כאשר הקולטן היעד כבר היה ידועביטוי אקטופי nd הושג בקלות. אולם לעתים קרובות, יש צורך ללמוד nAChRs בסביבה הטבעית שלהם: בתאי עצב בתוך פרוסות מוח חריף נקטפו מעכברים או חולדות מעבדה. לדוגמה, עכברים להביע יחידות משנה "רגישות יתר" nAChR כגון α4 עכברי L9'A 1 ועכברי α6'S L9 2, מאפשר זיהוי חד משמעי של נוירונים המבוססים על ביטוים התפקודי של מקטע nAChR ספציפי. למרות שהקלטות מהדקות תיקון כל תא מתאי עצב בפרוסות מוח נעשות באופן שגרתי על ידי electrophysiologist המיומן, הוא מאתגר מקומי כדי להחיל תרופות כגון אצטילכולין או ניקוטין לתא נרשם בתוך פרוסת מוח. הדילול של תרופות לתוך superfusate (יישום אמבטיה) הוא לא מהירות הפיך, ומערכות U-צינור אינן מותאמות בקלות לעבודה עם פרוסות מוח.
במאמר זה, אנו מתארים שיטה ליישום במהירות תרופות nAChR-מפעילות לנוירונים שנרשמו במבוגרים מ 'ouse פרוסות מוח. קלטות סטנדרטיות כל תאים עשויות מנוירונים בפרוסות, וmicropipette שני, מלאי סמים של הריבית תמרן לעמדה ליד התא המוקלט. הזרקה של אוויר דחוס או חנקן אינרטי לתוך פיפטה תרופה המלאה גורמת לכמות קטנה של פתרון תרופה להיפלט פיפטה אל התא המוקלט. באמצעות שיטה זו, זרמי nAChR בתיווך יכולים להיפתר ברמת דיוק של האלפית שני. זמני יישום תרופה בקלות יכולים להיות מגוונים, ופיפטה תרופה המלאה ניתן חזרה בו והחליפה עם פיפטה חדשה, המאפשרת לעקומות ריכוז בתגובה לתיוצרנה לנוירון בודד. למרות שתאר בהקשר של nAChR נוירוביולוגיה, טכניקה זו צריכה להיות שימושית ללימוד סוגים רבים של ערוצי יגנד מגודרי יון או קולטנים בתאי עצב מפרוסות מוח.
Protocol
Representative Results
Discussion
השיטה שהוצגה במאמר זה היא רחב שימושית לחקר תפקוד ערוץ היון יגנד מגודר בהכנות פרוסות מוח. עם זאת, יש מספר גורמים שישפיעו באופן משמעותי את האיכות והשחזור של נתונים ניסיוניים הנובעים מניצול שיטה זו. לדוגמה, זרמים מעוררים רגישים מאוד לקוטר של קצה פיפטה תרופה המלאה. טיפים …
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי המכונים הלאומיים לבריאות (NIH) המענק DA030396. תודה לחברים במעבדת Drenan לדיון וביקורת של כתב היד מסייע. תודה מיוחדת למי ראן קים לסיוע טכני וג'ונתן תומס טינג לייעוץ לגבי פרוסות מוח עכבר בוגרות.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| N-Methyl D-glucamine | Sigma | M2004 |
| KCl | Sigma | P3911 |
| NaH2PO4 | Sigma | S9638 |
| NaHCO3 | Sigma | S6014 |
| HEPES | Sigma | H3375 |
| glucose | Sigma | G5767 |
| Na+ ascorbate | Sigma | A4034 |
| thiourea | Sigma | T8656 |
| Na+ pyruvate | Sigma | P2256 |
| MgSO4•7H2O | Sigma | 230391 |
| CaCl2•2H20 | Sigma | 223506 |
| NaCl | Sigma | S9625 |
| Na+ pentobarbital | Vortech Pharmaceuticals | 76351315 |
| potassium gluconate | Sigma | G4500 |
| EGTA | Sigma | E3889 |
| Mg-ATP | Sigma | A9187 |
| GTP | Sigma | G8877 |
| DSK-Zero 1 Vibrating slicer | Ted Pella, Inc. | |
| P-97 Flaming/Brown micropipette puller | Sutter | |
| RC-27 Recording chamber | Warner | |
| TC-344B Perfusion heater controller | Warner | 640101 |
| SH-27B Solution heater | Warner | 640102 |
| Nikon FN-1 | Nikon | |
| C-7500 CCD Video camera | Hamamatsu | |
| Picospritzer III | General Valve Co. | |
| MP-285 Micromanipulator | Sutter | |
| PA-100 Piezoelectric translator | piezosystem jena, Inc. | |
| 12V40 piezo amplifier | piezosystem jena, Inc. | |
| Axopatch 200B | Molecular Devices Corp. | |
| Digidata 1440A | Molecular Devices Corp. |
References
- Tapper, A. R. Nicotine activation of ?4* receptors: sufficient for reward, tolerance, and sensitization. Science. 306, 1029-1032 (2004).
- Drenan, R. M. In vivo activation of midbrain dopamine neurons via sensitized, high-affinity ?6* nicotinic acetylcholine receptors. Neuron. 60, 123-136 (2008).
- Zhao, S. Cell type-specific channelrhodopsin-2 transgenic mice for optogenetic dissection of neural circuitry function. Nat. Methods. 8, 745-7452 (2011).
- Peca, J. Shank3 mutant mice display autistic-like behaviours and striatal dysfunction. Nature. 472, 437-442 (2011).
- Zhou, F. M., Wilson, C. J., Dani, J. A. Cholinergic interneuron characteristics and nicotinic properties in the striatum. J. Neurobiol. 53, 590-605 (2002).
- Pidoplichko, V. I. Nicotine activates and desensitizes midbrain dopamine neurons. Nature. 390, 401-404 (1997).
- Nashmi, R. Chronic nicotine cell specifically upregulates functional ?4* nicotinic receptors: basis for both tolerance in midbrain and enhanced long-term potentiation in perforant path. J. Neurosci. 27, 8202-8218 (2007).
- Xiao, C. Chronic nicotine selectively enhances ?4?2* nicotinic acetylcholine receptors in the nigrostriatal dopamine pathway. J. Neurosci. 29, 12428-12439 (2009).
- Cohen, B. N. Nicotinic cholinergic mechanisms causing elevated dopamine release and abnormal locomotor behavior. 神经科学. 200, 31-41 (2012).
- Drenan, R. M. Cholinergic modulation of locomotion and striatal dopamine release is mediated by α6β4* nicotinic acetylcholine receptors. J. Neurosci. 30, 9877-9889 (2010).
- Grady, S. R. Structural differences determine the relative selectivity of nicotinic compounds for native α4β2*-, α6β2*-, α3β4*- and α7-nicotine acetylcholine receptors. Neuropharmacology. 58, 1054-1066 (2010).
- Drenan, R. M. Subcellular trafficking, pentameric assembly, and subunit stoichiometry of neuronal nicotinic acetylcholine receptors containing fluorescently labeled α6 and β3 subunits. Mol. Pharmacol. 73, 27-41 (2008).
- Keath, J. R. Differential modulation by nicotine of substantia nigra versus ventral tegmental area dopamine neurons. J. Neurophysiol. 98, 3388-3396 (2007).
- Mansvelder, H. D. Bupropion inhibits the cellular effects of nicotine in the ventral tegmental area. Biochem. Pharmacol. 74, 1283-1291 (2007).
- Lee, S. The largest group of superficial neocortical GABAergic interneurons expresses ionotropic serotonin receptors. J. Neurosci. 30, 16796-16808 (2010).
- Margolis, E. B. Reliability in the identification of midbrain dopamine neurons. PLoS One. 5, e15222 (2010).
- Margolis, E. B. The ventral tegmental area revisited: is there an electrophysiological marker for dopaminergic neurons. J. Physiol. 577 (Pt 3), 907-924 (2006).
- Couey, J. J. Distributed network actions by nicotine increase the threshold for spike-timing-dependent plasticity in prefrontal cortex. Neuron. 54, 73-87 (2007).
- Yang, K. Distinctive nicotinic acetylcholine receptor functional phenotypes of rat ventral tegmental area dopaminergic neurons. J. Physiol. 587, 345-361 (2009).
- Endo, T. Nicotinic acetylcholine receptor subtypes involved in facilitation of GABAergic inhibition in mouse superficial superior colliculus. J. Neurophysiol. 94, 3893-3902 (2005).
- Bouzat, C. New insights into the structural bases of activation of Cys-loop receptors. J. Physiol. Paris. , (2011).
