Ventral Chick orta beyin içinde MikroRNA ovo İfade
Summary
Dış ifade beyin gelişiminde microRNA rolünü izah etmek için bir tekniktir. Ancak, ovo elektroporasyon kullanarak belirli alanları hedefleyen zordur. Burada, biz verimli bir şekilde seçici electroporate ventral ve dorsal orta beyin bölgeleri göstermek.
Abstract
Kodlayıcı olmayan RNA'lar gen ekspresyonunu düzenleyen ek oyuncular. Belirli alanlarda ovo elektroporasyon Hedefli ektopik mıkroRNA ifade mekansal ve zamansal kontrolü için eşsiz bir araç sağlar. Ancak, ventral orta beyindeki gibi ventral beyin yapıları herhangi manipülasyonlar için ulaşmak oldukça zordur. Burada, biz ince platin elektrotlar kullanılarak ventral orta beyindeki içine miRNA electroporate için etkili bir yol göstermektedir. Bu yöntem, orta beyin ve in vivo çalışmalar için yararlı bir araç içinde belirli alanlarda transfekte etmek için güvenilir bir yol sunar.
Introduction
Gen ifadesi için ek oynatıcılar gibi küçük kodlayıcı olmayan RNA'lar tanınması genomik programlama / gen düzenlemesi için yeni bir karmaşıklığı başlattı. Kodlayıcı olmayan RNA'lar, küçük farklı türlerin kodlayıcı olmayan RNA'lar 1-4 de dahil olmak üzere sinir hücreleri, fonksiyonel öneme sahiptir. Örneğin MicroRNA (miR veya MiRNA), gelişmekte olan beyin 5 ayrı ve değişen ekspresyon profillerini göstermektedir. Gelişim sırasında gen ifadesinin ve sessizliğini zamansal ve mekansal kontrolü için eşsiz bir fırsat civciv embriyo ovo elektroporasyon sağlar Hedefli.
Bu video elektroporasyon 6-10 ovo kullanarak civciv Ortabeyin belirli alanlarda Mirs ektopik ifadesi yerine farklı adımları gösterir. Hücrelerde bu küçük kodlayıcı olmayan RNA'lar, uzun süreli bir etki sağlamak için, Mirs DNA dizisidir mono-ya da bi-sistronik vektörlerine klonlanmıştır. Ovo elektroporasyon için, miR v içerenector yumurta kabuğu içinde küçük bir pencere yaptıktan sonra embriyo maruz bırakılması ile orta beyin nöral tüp içine enjekte edilir. Ortabeyin küçük artı (anot) ve eksi (katot) belirli alanlarda transfect platin elektrot belirli pozisyonlarda yerleştirilir. Ventral orta beyin transfeksiyon için, anot sol ventral orta beyinde ve bir akım uygulamadan önce Ortabeyin sağ yarısı üzerinde katot altına yerleştirilir. Kabuğu içindeki açma bandı ile kapatılır ve embriyo sürece herhangi bir analiz için gerekli olan süre ile inkübe edilir. Bu yöntem, ilk Muramatsu, et al. 6 ile tarif edilen ve belirli bir alan transfeksiyonu için Momose et al. 8 ile geliştirilmiştir.
Şematik bir bakış.
- Yumurtanın embriyo th içine küçük bir pencere keserek maruz kalmaktadıre kabuğu.
- Çözünmüş vektör (ler) bir mikro kapiller kullanılarak orta beyin içine enjekte edilir.
- Iki elektrot – paralel veya embriyo altına ve üstüne yerleştirilir – darbeli bir elektrik alanı oluşturur.
- Elektrik alanı geçici olarak anot 11,12 çekiliyor negatif yüklü DNA (veya RNA) ile hücre içine girişini kolaylaştırmak hücre zarında gözenekler oluşturur.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu video civciv Ortabeyin belirli alanların nöroepitel hücrelere plazmid transfect için etkili bir yöntemi gösterir. Düşük voltaj dikdörtgen elektrik darbeleri 6,16 ovo civciv nöral tüpün hücrelerine DNA 'nın neden olabilir. Bununla birlikte, DNA hedefleme doğruluğu genellikle nispeten büyük elektrotlar (Φ = 0.5 mm) üzerinden yükselir geniş elektrik alanı tarafından engellenmektedir. Biz Momose vd. 8 yönergeleri izleyerek küçük çaplı elektrotlar …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Biz mıR resim için bu film ve M. Nicolescu başlangıç aşamasında katkıda K. Mikic, kabul. C. Huber Universtitätsklinikum Tübingen Fortune program tarafından Universtitätsklinikum Tübingen IZKF, A. Alwin Prem Anand bir burs ile desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Model | |
| Borosillicate glass capillaries | Hartenstein | Model: 0.9 mm | |
| Microcapillary puller | WPI, Berlin | Model: Pul1-E | |
| Electroporator | Intracel | Model: TSSIC | |
| Stereomicroscope – fluorescence | LEICA | Model: MZFLIII | |
| Stereomicroscope | Zeiss | Model: Stemi | |
| Camera and software | Zeiss | Model: Axiocam MRc/ Axiovision Re. 4.8 |
References
- Kutter, C., Svoboda, P. miRNA, siRNA, piRNA: Knowns of the unknown. RNA Biol. 5, 181-188 (2008).
- Szell, M., Bata-Csorgo, Z., Kemeny, L. The enigmatic world of mRNA-like ncRNAs: their role in human evolution and in human diseases. Semin. Cancer Biol. 18, 141-148 (2008).
- Li, X., Jin, P. Roles of small regulatory RNAs in determining neuronal identity. Nature reviews. Neuroscience. 11, 329-338 (2010).
- Riedmann, L. T., Schwentner, R. miRNA, siRNA, piRNA and argonautes: news in small matters. RNA Biol. 7, 133-139 (2010).
- Coolen, M., Bally-Cuif, L. MicroRNAs in brain development and physiology. Curr. Opin. Neurobiol. 19, 461-470 (2009).
- Muramatsu, T., Mizutani, Y., Ohmori, Y., Okumura, J. Comparison of three nonviral transfection methods for foreign gene expression in early chicken embryos in ovo. Biochem. Biophys. Res. Commun. 230, 376-380 (1997).
- Itasaki, N., Bel-Vialar, S., Krumlauf, R. Shocking’ developments in chick embryology: electroporation and in ovo gene expression. Nat. Cell Biol. 1, 203-207 (1999).
- Momose, T., et al. Efficient targeting of gene expression in chick embryos by microelectroporation. Dev. Growth Differ. 41, 335-344 (1999).
- Nakamura, H., Watanabe, Y. Misexpression of genes in brain vesicles by in ovo electroporation. Dev. Growth Differ. 42, 199-201 (2000).
- Voiculescu, O., Papanayotou, C., Stern, C. D. Spatially and temporally controlled electroporation of early chick embryos. Nat. Protoc. 3, 419-426 (2008).
- Neumann, E., Schaefer-Ridder, M., Wang, Y., Gene Hofschneider, P. H. transfer into mouse lyoma cells by electroporation in high electric fields. The EMBO journal. 1, 841-845 (1982).
- Potter, H., Weir, L., Leder, P. Enhancer-dependent expression of human kappa immunoglobulin genes introduced into mouse pre-B lymphocytes by electroporation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 81, 7161-7165 (1984).
- Krull, C. E. A primer on using in ovo electroporation to analyze gene function. Dev. Dyn. 229, 433-439 (2004).
- Canto-Soler, M. V., Adler, R. Optic cup and lens development requires Pax6 expression in the early optic vesicle during a narrow time window. Developmental biology. , 294-2119 (2006).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. 1951. Dev Dyn. 195, 231-272 (1992).
- Muramatsu, T., Nakamura, A., Park, H. M. In vivo electroporation: a powerful and convenient means of nonviral gene transfer to tissues of living animals (Review). Int J Mol Med. 1, 55-62 (1998).
- Agoston, Z., Li, N., Haslinger, A., Wizenmann, A., Schulte, D. Genetic and physical interaction of Meis2, Pax3 and Pax7 during dorsal midbrain development. BMC Dev Biol. 12, 10 (2012).
- De Pietri Tonelli, D., et al. Single-cell detection of microRNAs in developing vertebrate embryos after acute administration of a dual-fluorescence reporter/sensor plasmid. Biotechniques. 41, 727-732 (2006).
