Em Expression in ovo de microRNA em Ventral Pintinho Midbrain
Summary
A expressão ectópica é uma técnica para elucidar o papel microRNAs no desenvolvimento do cérebro. No entanto, em áreas específicas usando a eletroporação in ovo é um desafio. Aqui, vamos mostrar uma maneira eficiente para regiões do mesencéfalo ventral e dorsal seletiva electroporate.
Abstract
RNAs não-codificantes são jogadores adicionais na regulação da expressão gênica. Alvejado em eletroporação in ovo de áreas específicas fornece uma ferramenta única para o controle espacial e temporal da expressão do microRNA ectópica. No entanto, as estruturas cerebrais ventral como mesencéfalo ventral são bastante difíceis de alcançar por quaisquer manipulações. Aqui, nós demonstramos uma forma eficiente de electroporate miRNA em mesencéfalo ventral utilizando eletrodos de platina finas. Este método oferece uma maneira confiável de transfecção de áreas específicas do cérebro médio e uma ferramenta útil para estudos in vivo.
Introduction
O reconhecimento de pequenos RNAs não-codificantes como jogadores adicionais para a expressão do gene de lançar uma nova complexidade à regulamentação de programação / gene do genoma. Diferentes espécies de RNAs não-codificantes tem importância funcional em células neurais, incluindo pequeno RNAs não-codificantes 1-4. MicroRNAs (MIR ou miRNA), por exemplo, mostram perfis de expressão distintas e mutáveis em cérebros em desenvolvimento 5. Alvejado em eletroporação in ovo de embriões de galinha oferece uma oportunidade única para o controle temporal e espacial da expressão gênica e silenciamento durante o desenvolvimento.
Este vídeo demonstra as diferentes etapas da realização de expressão ectópica da RIM em áreas específicas do mesencéfalo garota usando eletroporação in ovo 6-10. Para assegurar um efeito de longa duração destes pequenos RNAs não-codificantes nas células, a sequência de ADN de RIM, foram clonados em vectores de mono-ou bi-cistronic. Pois em eletroporação in ovo, miR contendo vector é injectado no tubo neural mesencéfalo expondo o embrião depois de fazer uma pequena janela na casca do ovo. Para transfectar as áreas específicas do cérebro médio mais pequeno (ânodo) e negativo (cátodo) eléctrodos de platina são colocados em posições específicas. Para a transfecção do mesencéfalo ventral, o ânodo é colocado por baixo do mesencéfalo ventral esquerdo e o cátodo acima da metade direita do cérebro médio, antes de aplicar uma corrente. A abertura na casca do ovo é fechado com fita adesiva e os embriões foram incubados durante o tempo necessário para qualquer análise. Este método foi originalmente descrito por Muramatsu et al. 6 e melhorado por Momose et al. 8 para transfecção área específica.
Visão esquemática.
- O embrião no ovo é exposta pelo corte de uma pequena janela em the casca de ovo.
- O vector dissolvido (s) é injectado no mesencéfalo usando um tubo capilar de micro.
- Dois eletrodos colocados – paralelo ou por baixo e por cima do embrião – gerar um campo elétrico pulsado.
- O campo eléctrico temporalmente cria poros na membrana da célula, que facilitam a entrada na célula de ADN carregadas negativamente (ou RNA) atraídos para o ânodo 11,12.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este vídeo demonstra um método eficaz para transfectar plasmídeo nas células neuroepiteliais de áreas específicas do cérebro médio do pintainho. Pulsos elétricos retangulares de baixa tensão pode introduzir DNA em células do tubo neural garota em ovo 6,16. No entanto, a precisão da segmentação DNA é muitas vezes dificultada pela grande campo elétrico, que sobe através das relativamente grandes eletrodos (Φ = 0,5 mm). Nós tentamos resolver esse problema usando eletrodos menores em d…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Reconhecemos K. Mikic, que contribuiu para a fase inicial deste filme e M. Nicolescu para a imagem miR. C. Huber foi apoiado por uma bolsa da IZKF do Universtitätsklinikum Tübingen, A. Alwin Prem Anand pelo programa fortuna do Universtitätsklinikum Tübingen.
Materials
| Name | Company | Model | |
| Borosillicate glass capillaries | Hartenstein | Model: 0.9 mm | |
| Microcapillary puller | WPI, Berlin | Model: Pul1-E | |
| Electroporator | Intracel | Model: TSSIC | |
| Stereomicroscope – fluorescence | LEICA | Model: MZFLIII | |
| Stereomicroscope | Zeiss | Model: Stemi | |
| Camera and software | Zeiss | Model: Axiocam MRc/ Axiovision Re. 4.8 |
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