Sequential Photo-Bleiche zur Einzel-Schwann-Zellen an der neuromuskulären Synapse Delineate

Sequentielle Photobleichen stellt eine nicht-invasive Methode zur individuellen SCs im NMJ etikettieren. Die NMJ ist die größte Synapsen des Nervensystems der Säuger-System und ist als Leitbild zur synaptischen Struktur und Funktion zu untersuchen serviert. In Maus NMJs Motors Axonterminalen bilden Brezel-like Kontaktstellen mit Muskelfasern. Der Motor Axon und sein Terminal werden von SCs ummantelt. In den vergangenen Jahrzehnten haben mehrere transgene Mäuse generiert, um Motoneuronen und SCs visualisieren, zum Beispiel Thy1-XFP ¹ und Plp-GFP Mäusen ^2.

Motor entlang Axone werden myelinisierenden axonalen SCs in nicht überlappenden Internodien angeordnet, getrennt durch Knoten Ranvier, um saltatorische Aktionspotential Ausbreitungsrichtung aktivieren. Im Gegensatz dazu sind Endgerät SCs an der Synapse spezialisierten Gliazellen, welche zu überwachen und zu fördern Neurotransmission, verdauen Schutt und Führung regenerierenden Axone. NMJs eng um bis zu einem halben Dutzend nicht MYEL abgedecktinating Endgerät SCs – dies kann jedoch nicht durch Lichtmikroskopie individuell aufgelöst werden, da sie in direktem Kontakt Membran ³ befinden.

Mehrere Ansätze existieren individuell visualisieren Terminal SCs. Keiner von ihnen sind makellos, though. Zum Beispiel erfordert Farbstoff Füllung, wobei einzelne Zellen mit einem Farbstoff gefüllten Mikroelektrode aufgespießt werden, Zerstören eines markierten Zelle vor dem Befüllen eine zweite. Dies ist nicht kompatibel mit anschließender Zeitraffer-Aufnahmen ^3. Multispektrales "Brainbow" Kennzeichnung von SCs ist durch Verwendung kombinatorischer Expression von fluoreszierenden Proteinen ⁴ erreicht. Allerdings erfordert diese Technik, die mehrere Transgene und wird durch die Expressionsmuster der verwendeten Promotoren beschränkt. In Zukunft könnte Ausdruck "photoschaltbare" Proteine ​​in SCs noch eine andere alternative ⁵ sein. Hier präsentieren wir sequentielle Fotobleichen, wo einzelne Zellen gebleicht werden, und ihr Image durch Subtraktion erhalten. Wir glauben,dass dieser Ansatz – aufgrund seiner Einfachheit und Vielseitigkeit – eine dauerhafte Neben der Neurowissenschaftler Technologie-Palette, zumal es in vivo verwendet werden können und auf andere übertragen Zelltypen, anatomischen oder Arten ^6.

In dem folgenden Protokoll, Detail wir die Anwendung der sequentiellen Bleichen und anschließende konfokale Zeitraffer-Mikroskopie an Klemme SCs in triangularis sterni Muskel-Explantaten. Diese dünne, oberflächliche und einfach zerlegt Nerv-Muskel-Präparat ^7,8 hat sich für ein Studium der NMJ Entwicklung, Physiologie und Pathologie ⁹ nützlich. Schließlich erklären wir, wie die triangularis sterni Muskeln bereit ist nach der Fixierung durchzuführen korreliert hochauflösende konfokale Bildgebung, Immunhistochemie oder ultrastrukturelle Untersuchungen.