Realizar el lavado de la vagina, tinción de cristal violeta y Evaluación citológica vaginal para ratón Celo identificación Staging Ciclo

1. Preparación de Reactivos Para el lavado vaginal estéril, autoclave agua doblemente destilada (DDH 2 O) y guárdela en un recipiente herméticamente cerrado, a temperatura ambiente hasta que se necesite. Para la evaluación citológica, añadir 0,1 g de polvo de cristal violeta a 100 ml de ddH 2 O. Mezclar bien. Tinción de cristal violeta (0,1%) se puede almacenar en un recipiente herméticamente cerrado a temperatura ambiente hasta que se necesite. 2. Recolección de células vaginales (lavado vaginal) Colocar una bombilla de látex en el extremo de una punta estéril 200 l y elaborar aproximadamente 100 l de ddH 2 O estéril utilizando las gradaciones en la punta como una guía volumen. Levante el ratón fuera de su jaula y coloque la jaula en la tolva (tapa) con su extremo trasero / trasero hacia usted. Sujete firmemente la cola y elevar el extremo posterior. El ratón tendrá ahora sólo sus patas delanteras prensiles la tolva. En este punto, el ratón puede orinar. Si es así, Espere hasta que deje de orinar. ¿Debería haber orina que queda en la entrada del canal vaginal, es posible que desee aclarar la abertura con el exceso de O 2 ddH usando una punta diferente (es decir, no con la punta de recogida de muestras). Coloque el extremo de la ddH 2 O llena de punta en la abertura del canal vaginal, teniendo cuidado de no penetrar en el orificio vaginal como (y cervical) estimulación puede inducir pseudopreñez en ratas 1,2. Los informes recientes sugieren que los ratones son menos susceptibles a este efecto, sin embargo se debe tener cuidado para reducir al mínimo el grado de invasividad en análisis repetidos 3. Presione suavemente la bombilla para expulsar un cuarto a la mitad del volumen de agua (~ 25-50 l) en la apertura del canal vaginal. El líquido aspirado de forma espontánea en el canal sin la punta de inserción. Lentamente libere la presión ejercida sobre el bulbo. El fluido se retire de nuevo en la punta. Evite liberación de presión demasiado rápido para evitar la aspiración de líquidoen el bulbo. Una punta filtrada puede ser útil para este propósito. Repetir los tiempos de las etapas anteriores 4-5 utilizando la misma punta, bulbo, y el líquido para obtener un número suficiente de células en una sola muestra. Coloque el fluido sobre portaobjetos de vidrio, y permitir que el frotis se seque por completo a temperatura ambiente. Una vez seca, estos frotis estrales puede teñir inmediatamente o almacenarse y se tiñeron en una fecha posterior. 3. Tinción citológica utilizando Crystal Violet * 4 Colocar el portaobjetos en seco en un vaso de Coplin (u otro recipiente de tinción comparable) que contiene el colorante cristal violeta durante 1 min. Retirar a un segundo vaso de Coplin que contiene ddH 2 O. Lave el portaobjetos con ddH 2 O durante 1 min. Repetir. Retire el exceso ddH 2 O de los bordes de la diapositiva con un limpiador de tejidos ligeros, evitando el contacto con la tinción. Pipetear aproximadamente 15 l de glicerol en la parte superior de la tinción y la taparesbale. Alternativamente, otros reactivos histológicos de montaje pueden ser utilizados para obtener un más permanente, no difusora mancha. * El método de tinción descrito aquí es el procedimiento más simple que puede realizarse en cualquier laboratorio. Otros métodos pueden proporcionar detalles adicionales. Por ejemplo, mediante la tinción de Papanicolaou, la madurez de las células epiteliales nucleadas se pueden distinguir con células menos maduras maduras células teñidas de color turquesa y más rosa o anaranjado-teñidas. Estas diferencias se pueden utilizar para la etapa proestro temprano o tardío. 4 4. Citología Vaginal Examinar el frotis al microscopio óptico para determinar los tipos de células presentes. El examen microscópico se debe hacer inmediatamente después de la tinción de cristal violeta como se difundirá a partir de las células con el tiempo cuando se usa glicerol para cubreobjetos. Las microfotografías deben tomarse en el momento de análisis para documentar la citología. Comience por examinar la entire frotis con un aumento menor. Seleccione un área representativa y pasar a un mayor aumento. Verá cornificación células epiteliales escamosas, leucocitos, y / o células epiteliales nucleadas (resultados representativos, la figura 1A-C). La proporción de células presentes le permitirá determinar la etapa de estro de su ratón en el momento de la toma de muestras (resultados representativos, Figura G-1D) y su estado hormonal inmediata (discusión, Figura 2). 5. Los resultados representativos Citología: Tres tipos de células primarias pueden ser detectados en muestras de frotis vaginales: (1) células nucleadas epiteliales (Figura 1A), (2) cornificación células epiteliales escamosas (Figura 1B), y (3) los leucocitos (Figura 1C). Nucleados células epiteliales tienen un citoplasma ligeramente manchado, manchado oscuro membrana plasmática, y un núcleo oval ( <strong> Figura 1A). Cornified células epiteliales escamosas son uniformemente manchado, más de forma poligonal que sus predecesores epiteliales nucleadas, y carecen de un núcleo (Figura 1B). Los leucocitos polimorfonucleares se pueden distinguir de las células epiteliales por su forma irregular, núcleos polimórfico oscuro manchado, y el pequeño tamaño (Figura 1C, las flechas negras). En caso de contaminación de la orina estar presente en el frotis, cristales de ácido úrico se detectan fácilmente por sus estructuras cristalinas diferentes a cualquier tipo de celda esperados (Figura 3). Si esto ocurre, y la detección oscura de tipo celular predominante, la prueba debe ser desechado y no se utiliza para fines de estadificación. Montaje: La proporción relativa de los tipos de células observadas en frotis se puede utilizar para identificar la fase del ciclo estral de su ratón en el día de la recogida de muestras (Figura 1D-G). Durante el proestro, las células son casi exclusivamenteracimos de vuelta, bien formado nucleados células epiteliales (Figura 1D, célula representativa indicada por la flecha blanca). Durante el estro, las células son predominantemente cornificación células epiteliales escamosas, presentes en racimos compactados (Figura 1E, célula representante indicado por punta de flecha). Durante metaestro, pequeñas leucocitos oscuramente teñidos predominan (Figura 1F, célula representativa indicada por la flecha negro). Cornified células epiteliales escamosas se puede observar, a menudo en fragmentos, (Figura 1F, célula representativa indicada por negro punta de flecha). Durante el diestro, raras cornificadas células epiteliales escamosas puede aún estar presente (Figura 1G, célula representativa indicada por negro punta de flecha), sin embargo aún predominan los leucocitos (Figura 1G, célula representativa indicada por la flecha negro). Metaestro puede distinguirse de diestro por la aparición de células epiteliales nucleadas en diestro ( <stron g> Figura 1G, célula representativa indicada por la flecha blanca). Figura 1. Evaluación citológico de frotis vaginal puede ser utilizado para identificar la etapa estral tres principales tipos de células se detectan en muestras de frotis vaginales:. (A) las células epiteliales nucleadas, (B) cornificadas células epiteliales escamosas, y leucocitos (C). La proporción de estos tipos de células presentes en el frotis se puede utilizar para identificar en ratones (D) proestro, (E) estro, (F) metaestro, o diestro (G) como se describe en los resultados representativos. Puntas de flecha negras en E, F y G a punto representativos cornificadas células epiteliales escamosas. Las flechas negras en C, F y G a punto leykocytes representativas. Las flechas blancas en D y G representante más destacado nucleados células epiteliales. . Jpg "alt =" Figura 2 "/> Figura 2. Citología vaginal smear refleja hechos subyacentes endocrinos. Detalles se proporcionan también en discusión. Haga clic aquí para ampliar la cifra . Figura 3. Cristales de ácido úrico puede estar presente siguiente de tinción de cristal violeta de orina contaminados-muestras. (A) los cristales son transparentes y pueden ser de varios tamaños (flechas y la región en caja magnificados en (B)). No hay células están presentes en este campo. En caso de contaminación úrico cristales de ácido dentro de los campos utilizados para la tinción citológica estar presente, puede ser difícil identificar con precisión los tipos de células presentes y el frotis debe ser desechado. Las barras de escala = 50 micras.