Выполнение промывание влагалища, кристаллический фиолетовый окрашивания и вагинальные цитологические Оценка для мыши эстрального идентификации Постановка цикла

1. Подготовка реагентов Для стерильной промывание влагалища, автоклав дважды дистиллированной воде (DDH 2 O) и хранить в плотно закрытой посуде при комнатной температуре, пока это необходимо. Для цитологической оценки, добавляют 0,1 г порошка кристаллического фиолетового до 100 мл DDH 2 O. Все хорошо перемешать. Кристаллический фиолетовый пятно (0,1%) могут быть сохранены в плотно закрытой посуде при комнатной температуре, пока это необходимо. 2. Сбор вагинальные клетки (промывание влагалища) Поместите латекса лампочка на конце стерильный 200 мкл наконечник и составляет примерно 100 мкл стерильной DDH 2 O помощью градации на кончике как объем руководства. Поднимите мышь из своей клетки и поместить ее в бункер клетки (крышки) с ее задние / задней по отношению к вам. Крепко возьмитесь за хвост и поднять заднюю часть. Мыши теперь будет только ее передние лапы захвата бункера. В этот момент мышь может помочиться. Раз так, Подождите, пока мочеиспускание прекращается. Должны ли быть моча оставили у входа в вагинальный канал, вы можете промыть открытия с избыточным DDH 2 O помощью отдельного наконечник (т. е. не ваши пробы совет). Поместите конец DDH 2 O заполненные чаевых на открытие влагалища заботясь, чтобы не проникают в отверстия, как вагинальный (и шейки) стимуляция может вызвать ложная беременность у крыс 1,2. Последние сообщения свидетельствуют о мышах менее подвержены этот эффект тем не менее, следует соблюдать осторожность, чтобы минимизировать степень инвазии при повторных анализах 3. Слегка нажмите на лампу, чтобы изгнать четверти до половины объема воды (~ 25-50 мкл) на открытии вагинальный канал. Жидкость самопроизвольно аспирации в канал без наконечника вставки. Медленно отпустите давление на лампочку. Жидкость уйдет обратно в чаевых. Избегайте выпуская давление слишком быстро для предотвращения аспирации жидкостив луковицу. Фильтруют чаевые могут быть полезны для этой цели. Повторите предыдущий шаг в 4-5 раз, используя тот же совет, лампы, жидкости и получить достаточное количество клеток в одном образце. Поместите жидкости на стекло, и позволяют мазка, чтобы полностью высохнуть при комнатной температуре. После высыхания, эти эстрального мазков могут быть окрашены сразу или хранить и окрашивают в более поздние сроки. 3. Цитологическое окрашивание использованием Crystal Violet * 4 Поместите сухой слайд в банке Коплин (или других аналогичных судна окрашивание), содержащих кристаллический фиолетовый пятном в течение 1 мин. Удалить ко второму банку Коплин содержащие DDH 2 O. Вымойте слайды с DDH 2 O в течение 1 мин. Повторить. Удалите излишки DDH 2 O от края слайда с легких тканей стеклоочистителя, избегая контакта с окрашенного мазка. Внесите примерно 15 мкл глицерина в верхней части мазка и крышкискользить. Кроме того, другие гистологические монтажа реагенты могут быть использованы для получения более постоянного, не диффундирующего пятно. * Окрашивания методом, описанным здесь является простейшей процедурой, которая может быть выполнена в любой лаборатории. Другие методы могут дать дополнительную информацию. Например, с помощью окрашивания по Папаниколау, зрелость ядерные эпителиальные клетки могут быть выделены с менее зрелых клеток, окрашенных бирюзовых и более зрелые клетки розового или оранжево-окрашенные. Эти различия могут быть использованы на сцену рано или поздно проэструса 4. 4. Вагинальные цитологии Изучите мазок под световым микроскопом, чтобы определить типы клеток присутствуют. Микроскопическое исследование должно быть сделано сразу после окрашивания, как кристаллический фиолетовый будет диффундировать из клеток с течением времени при использовании глицерина для coverslipping. Микрофотографии должны быть приняты во время анализа к документу цитологии. Начните с изучения entirэлектронной мазок на более низком увеличении. Выберите представитель площадь и перейти на более высокий увеличения. Вы увидите рогового эпителиальных клеток, лейкоцитов, и / или ядерные эпителиальные клетки (представительных результатов рис. 1А-C). Отношение настоящее клеток позволит вам определить эстрального этап вашей мыши в момент взятия пробы (представительных результатов, Рис. 1D-G) и ее ближайших гормонального статуса (обсуждение, рисунок 2). 5. Представитель Результаты Цитология: Три основных типа клеток могут быть обнаружены в образцах мазков вагинального: (1) ядерные эпителиальные клетки (рис. 1а), (2) рогового клеток плоского эпителия (рис. 1б), и (3) лейкоциты (рис. 1С). Ядросодержащих эпителиальные клетки имеют слегка окрашенные цитоплазмы, темнее окрашенный плазматической мембраны, и овальные ядра ( <strОнг> рис. 1А). Ороговевших клеток плоского эпителия равномерно окрашенные, более полигональной формы, чем их ядерные эпителиальные предшественников, и не имеют ядра (рис. 1б). Полиморфноядерных лейкоцитов можно отличить от эпителиальных клеток, их неправильной формы, темно окрашенные полиморфными ядрами, и небольшого размера (рис. 1С, черные стрелки). Если моча загрязнения присутствовать в мазке, кристаллы мочевой кислоты легко обнаружить их кристаллической структуры отличаются от любых ожидаемых типов клеток (рис. 3). Если это произойдет, и неясно выявление преобладающего типа клеток, мазок должен быть отброшен и не используется для постановки целей. Постановка: относительное соотношение типов клеток наблюдается в мазках могут быть использованы для определения стадии эстрального цикла мышь в день взятия пробы (рис. 1D-G). Во время проэструса, клетки почти исключительнокластеров круглые, хорошо сформированные зарождаются эпителиальные клетки (рис. 1D, представитель ячейки указывает белая стрелка). Во время течки, клетки рогового преимущественно эпителиальных клеток, присутствующих в плотно упакованных кластеров (рис. 1E, представитель ячейки указано стрелкой). Во время metestrus, небольшие темно окрашенных лейкоцитов преобладают (рис. 1F, представитель ячейки указывает черная стрелка). Ороговевших клеток плоского эпителия может наблюдаться, часто фрагментов (рис. 1F, представитель ячейки обозначены черными стрелка). Во время диэструса, редкие ороговевших клеток плоского эпителия могут все еще ​​присутствовать (рис. 1G, представитель ячейки обозначены черными стрелки), однако по-прежнему преобладают лейкоциты (рис. 1G, представитель ячейки указывает черная стрелка). Metestrus можно отличить от диэструса появление ядерных эпителиальных клеток в диэструса ( <stron г> Рисунок 1G, представитель ячейки указывает белая стрелка). Рисунок 1. Цитологическое оценки влагалищных мазков может быть использована для идентификации эстрального этапе три основных типа клеток обнаружены в вагинальных образцах мазков.: (A) ядерные эпителиальные клетки, (B) ороговевших клеток плоского эпителия, и (C) лейкоцитов. Соотношение этих типов клеток, присутствующих в мазке может быть использована для идентификации мышей (D) проэструса, (E) течки, (F) metestrus, или (G) диэструса, как описано в представительные результаты. Черные стрелки в E, F и G указывают на представителя ороговевших клеток плоского эпителия. Черные стрелки на C, F и G указывают на представителя leykocytes. Белые стрелки D и G выделить представителя зарождаются эпителиальных клеток. . JPG "ALT =" Рисунок 2 "/> Рисунок 2. Вагинальная цитология мазков отражает основные события внутренней секреции. Подробная информация также предоставляется в дискуссии. Нажмите, чтобы увеличить показатель . Рисунок 3. Кристаллов мочевой кислоты может присутствовать следующие окрашивания кристаллическим фиолетовым мочи загрязненные образцы. (A) Кристаллы прозрачны и могут быть различных размеров (стрелки и коробку регионе увеличиваются в (B)). Нет клетки присутствуют в этой области. Если мочевой кислоты кристаллов загрязнение в пределах полей, используемых для окрашивания цитологических присутствовать, это может быть трудно точно идентифицировать типы клеток, настоящее и мазок должен быть уничтожен. Шкала баров = 50 мкм.