Het uitvoeren van vaginale lavage, Crystal Violet kleuring, en vaginale cytologische Evaluatie Mouse loopsheid Staging identificatie
Summary
Hier beschrijven we hoe u de fase van het murine reproductieve (pro-oestrus, oestrus, metestrus of diestrus) door een eenvoudige, niet-invasieve verzamelen en cytologische beoordeling van de vaginale uitstrijkjes te identificeren. Verder hebben we beschrijven hoe vaginale cytologie weerspiegelt circulerende hormoonspiegels ten grondslag liggen aan de transitie door de murine voortplantingscyclus.
Abstract
Een snelle methode beoordelen voortplantingsstatus in knaagdieren is niet alleen nuttig in de studie van reproductieve dysfunctie, maar is ook vereist voor de productie van nieuwe muismodellen van de ziekte en onderzoek naar de hormonale regulatie van weefselafbraak (of regeneratie) na challenge pathologische. De muizen reproductieve (of oestrische) cyclus is verdeeld in 4 fasen: pro-oestrus, oestrus, metestrus, en diestrus. Gedefinieerd schommelingen in bloedspiegels van de ovariële steroïden 17-β-oestradiol en progesteron, luteïniserend de gonadotropines en follikel stimulerend hormonen en luteotropic prolactine signaalovergang door deze reproductieve fasen. Veranderingen in cel typologie binnen de murine vaginale kanaal weerspiegelen deze onderliggende endocriene gebeurtenissen. Dagelijkse beoordeling van de relatieve verhouding van kernhoudende epitheelcellen, verhoornde squameuze epitheelcellen en leukocyten in vaginale uitstrijkjes kan worden gebruikt om muizen oestrische identificerenstadia. De mate van invasiviteit echter werkzaam in het verzamelen van deze monsters kunnen reproductieve status veranderen en ontlokken een ontstekingsreactie die cytologische beoordeling van uitstrijkjes kunnen verwarren. Hier beschrijven we een eenvoudige, niet-invasieve protocol dat gebruikt kan worden om de fase van de loopsheid van een vrouwelijke muis te bepalen zonder dat haar voortplantingscyclus. We detail hoe onderscheid te maken tussen de vier stadia van de oestrische cyclus van verzameling en analyse van de overheersende cel typologie in vaginale uitstrijkjes en laten we zien hoe deze veranderingen kunnen worden geïnterpreteerd met betrekking tot endocriene status.
Protocol
Discussion
Deze veranderingen in cel typologie zijn indicatief van de onderliggende endocriene evenementen. De proestrus fase van de loopsheid overeenkomt met de menselijke folliculaire fase van de menstruele cyclus 5 en wordt gedefinieerd door een pre-ovulatoire verhoging van de circulerende 17-β-oestradiol niveaus 6, alsmede een kleine stijging van prolactine 7 (figuur 2, pro-oestrus, linker paneel). De verhoging van 17-β-estradiol stimuleert indirect gonadotropin releasing hormone neuronen in de hypothalamus en septum dat op zijn beurt reactieve cellen te activeren op de hypofysevoorkwab om luteïniserend hormoon en follikelstimulerend hormoon vrij in de circulatie 8,9 (figuur 2 , Proestrus, linker paneel). In uitstrijkjes dieren genomen in proestrus cellen bijna uitsluitend ovaal kernhoudende epitheelcellen (Figuur 1D, fig. 2 Proestrus, rechter paneel). De piek van het follikel-stimulerend Hormeen niveau signalen ovulatie en toegang tot estrus 10,11. Tijdens oestrus, 17-β-oestradiol-spiegels afnemen en prolactine niveaus een piek 6,7 (figuur 2, Estrus, linker paneel). Vaginale uitstrijkjes worden gekenmerkt door bijna exclusieve detectie van onregelmatig gevormde cornified squamous epitheliale cellen vaak in groepjes (Figuur 1E, figuur 2 Estrus, rechter paneel). Inwerking metestrus samenvalt met een voortdurende stijging van progesteron niveaus 6 en komt overeen met het begin van menselijke luteale fase 12 (figuur 2 Metestrus, linkerpaneel). Zoals progesteron niveaus beginnen te stijgen en er een kleine stijging in 17-β-oestradiol in reactie op corpus luteum activatie 6,13,14 (figuur 2 Metestrus, linkerpaneel). De celtypes aanwezig in vaginale uitstrijkjes tijdens deze fase zijn gefragmenteerd, verhoornde epitheelcellen en kleinere donkerder gekleurd leukocyten (Figure 1F, fig. 2 Metestrus, rechter paneel). Tenslotte inwerkingtreding diestrus bij muizen voorkomt en circulerende progesteron piek 6, overeenstemmend met het menselijk late luteale fase 12. Regressie van het corpus luteum leidt tot een volgende scherpe daling van progesteron levels 15,16 (figuur 2, Diestrus, linker paneel). Leukocyten overheersen in uitstrijkjes tijdens diestrus. De frequentie van verhoornde epitheelcellen verlaagd en gekiemd epitheelcellen beginnen vlak voor overgang naar proestrus (Figuur 1G, figuur 2 Diestrus, rechter paneel) worden gedetecteerd.
Samenvattend kan dit eenvoudige, routinematige protocol worden gebruikt om de dagelijkse hormonale schommelingen te schatten en oestrische fase in experimentele muizen vast te stellen zonder dat de voortplanting beschouwd indien de volgende voorzorgsmaatregelen worden getroffen. Bemonstering niet meer worden uitgevoerd dan eenmaal daags met de niet-invasieve protocol deschier ribed vergeleken met herhaalde penetratie van de vagina, aspiratie en agitatie. Dit kan vaginale irritatie leidt tot een ontstekingsreactie 17 waardoor leukocyten en andere celtypen aanwezig in uitstrijkjes die cytologisch onderzoek kunnen beïnvloeden. Bovendien, zelfs in kolonie gehuisvest vrouwen, is het normaal om uitgebreide diestrus en oestrus stadia te zien in verschillende muizen en inductie van anestrous 18 en deze identificatie is nuttig bij de interpretatie van hormonale effecten in de reproductieve, geslacht en ziekte studies. Variabiliteit in cycluslengte wordt geïntroduceerd met de leeftijd en van woningcorporaties verschillen binnen kolonies (individueel of in groep-behuizing) van de vrouwen 7,19-21. Vrouwtjes gehuisvest in vrouwelijke alleen-kolonies kunnen ophouden fietsen en voer een toestand van langdurige diestrus 18,22,23 maar fietsen kan hervat worden door blootstelling aan kooien voorbehandeld met mannelijke urine te fietsen 24,25 lokken. Dus om vast individual cycluslengtes voor een bepaalde muis wordt aanbevolen dat de niet-invasieve evaluatie beschreven dagelijks worden uitgevoerd met zorg tot twee volledige cycli waargenomen.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij willen Marc Leonard danken aan de Carleton Immersive Media Studio voor deskundige technische bijstand in videoproductie en bewerken en Dr Martin Bertrand van Carleton Immersive Media Studio / Neural Regeneration Laboratorium voor visueel model hulp. De auteurs zijn zeer erkentelijk het deskundig advies van Dr Marilyn Keaney en al haar toegewijde personeel aan de Universiteit van Ottawa Animal Care en veterinaire diensten. Dit werk werd gefinancierd door de Canadese Institute of Health Research (CIHR, MOP 62826) aan Salb, de CIHR Instituut voor Aging en strategische Training Initiative in Health Research / CIHR Training Program in Neurodegeneratieve lipidomics (TGF 96121) om Salb en SF, de Canadese Stichting voor Innovatie naar SF, Ontario Innovation Trust naar SF, en Autodesk onderzoek naar SF. ACM ontvangt een CIHR Banting en Best promotie award. NV ontvangt een post-professionele beurs van Institute of Aging en CIHR Training Program in neurodegeneratieve lipidomics.
Materials
| Name | Company | Catalogue # |
| Sterile 200 μl pipette tips | Diamed | E340901 |
| Latex bulb (1 ml) | Fisher | 03-488-21 |
| Glass microscope slides | Fisher | 12-550-15 |
| Crystal Violet stain (25 g) | Fisher | C581-25 |
| Light-duty Tissue Wipers | VWR | 82003-820 |
| Glycerol | Fisher | BP229-1 |
| Microscope Cover Glass (22×30) | Fisher | 12-544A |
References
- Adler, N. T., Zoloth, S. R. Copulatory behavior can inhibit pregnancy in female rats. Science. 168, 1480-1482 (1970).
- Adler, N. T., Resko, J. A., Goy, R. W. The effect of copulatory behavior on hormonal change in the female rat prior to implantation. Physiology. 5, 1003-1007 (1970).
- Yang, J. J., Larsen, C. M., Grattan, D. R., Erskine, M. S. Mating-induced neuroendocrine responses during pseudopregnancy in the female mouse. Journal of. 21, 30-39 (2009).
- Hong, H. Changes in the mouse estrus cycle in response to BRCA1 inactivation suggest a potential link between risk factors for familial and sporadic ovarian cancer. Cancer research. 70, 221-228 (2010).
- Hawkins, S. M., Matzuk, M. M. The menstrual cycle: basic biology. Annals of the New York Academy of Sciences. 1135, 10-18 (2008).
- Walmer, D. K., Wrona, M. A., Hughes, C. L., Nelson, K. G. Lactoferrin expression in the mouse reproductive tract during the natural estrous cycle: correlation with circulating estradiol and progesterone. Endocrinology. 131, 1458-1466 (1992).
- Parkening, T. A., Collins, T. J., Smith, E. R. Plasma and pituitary concentrations of LH, FSH, and prolactin in aging C57BL/6 mice at various times of the estrous cycle. Neurobiology of aging. 3, 31-35 (1982).
- Sarkar, D. K., Chiappa, S. A., Fink, G., Sherwood, N. M. Gonadotropin-releasing hormone surge in pro-oestrous rats. Nature. 264, 461-463 (1976).
- Rajendren, G., Gibson, M. J. A confocal microscopic study of synaptic inputs to gonadotropin-releasing hormone cells in mouse brain: regional differences and enhancement by estrogen. Neuroendocrinology. 73, 84-90 (2001).
- Kumar, T. R., Wang, Y., Lu, N., Matzuk, M. M. Follicle stimulating hormone is required for ovarian follicle maturation but not male fertility. Nature. 15, 201-204 (1997).
- Montgomery, V., Loutradis, D., Tulchinsky, D., Kiessling, A. FSH-induced ovulation in intact and hypophysectomized mice. Journal of reproduction and fertility. 84, 1-6 (1988).
- Mihm, M., Gangooly, S., Muttukrishna, S. The normal menstrual cycle in women. Animal reproduction science. , 124-229 (2011).
- Appelgren, L. E. Histochemical demonstration of drug interference with progesterone synthesis. Journal of reproduction and. 19, 185-186 (1969).
- Sander, V. A., Facorro, G. B., Piehl, L., de Celis Rubin, E., Motta, A. B. Effect of DHEA and metformin on corpus luteum in mice. Reproduction. 138, 571-579 (2009).
- Stocco, C., Telleria, C., Gibori, G. The molecular control of corpus luteum formation, function, and regression. Endocrine reviews. 28, 117-149 (2007).
- Rudolph, M. Induction of overt menstruation in intact mice. PLoS One. 7, e32922 (2012).
- Yano, J., Lilly, E., Barousse, M., Fidel, P. L. Epithelial cell-derived S100 calcium-binding proteins as key mediators in the hallmark acute neutrophil response during Candida vaginitis. Infection and immunity. 78, 5126-5137 (2010).
- Whitten, W. K. Occurrence of anoestrus in mice caged in groups. The Journal of endocrinology. 18, 102-107 (1959).
- Lamond, D. R. Effect of stimulation derived from other animals of the same species on oestrous cycles in mice. The Journal of endocrinology. 18, 343-349 (1959).
- Nelson, J. F., Felicio, L. S., Randall, P. K., Sims, C. A longitudinal study of estrous cyclicity in aging C57BL/6J mice: I. Cycle frequency, length and vaginal cytology. Biology of reproduction. 27, 327-339 (1982).
- Felicio, L. S., Nelson, J. F., Finch, C. E. Longitudinal studies of estrous cyclicity in aging C57BL/6J mice: II. Cessation of cyclicity and the duration of persistent vaginal cornification. Biology of reproduction. 31, 446-453 (1984).
- Van Der Lee, S., Boot, L. M. Spontaneous pseudopregnancy in mice. II. Acta physiologica et pharmacologica Neerlandica. 5, 213-215 (1956).
- Van Der Lee, S., Boot, L. M. Spontaneous pseudopregnancy in mice. Acta physiologica et pharmacologica Neerlandica. 4, 442-444 (1955).
- Armaiz-Pena, G. N. Estrous cycle modulates ovarian carcinoma growth. Clinical cancer research : an official journal of the American Association for Cancer Research. 15, 2971-2978 (2009).
- Jemiolo, B., Harvey, S., Novotny, M. Promotion of the Whitten effect in female mice by synthetic analogs of male urinary constituents. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 83, 4576-4579 (1986).
