ייצור והשימוש פיגי גב Multibarrel אלקטרודות ל<em> בחי</em> מניפולציות תרופתיות של תגובות עצביות

משוך אלקטרודות זכוכית משוך אלקטרודות זכוכית משוך האלקטרודה חבית אחת. השתמש זכוכית חבית אחת נימים עם נימה ולמשוך קצה לקוטר של כ 1-2 מיקרומטרים, אורך גל של 10-12 מ"מ, והתנגדות האלקטרודה מקבילה של כ 12 MOhm (טווח 5-20 MOhms) כפי שנמדד בתמיסת NaCl 0.9%. התנגדויות אלקטרודה נמוכות תבאנה בפעילות רקע יותר ולכן קשה יותר לבודד פעילות אחידה מתא עצב בודד. עבור משייכת אלקטרודה זו, השתמש בקו אופקי או אנכי חולץ עם או חוטי חימום או סלילי חימום. משוך האלקטרודה multibarrel. בשל קוטר הרבה יותר הגדול של זכוכית multibarrel ואת הצורך של פיזור חום אפילו סביב כל multibarrel, מושך חזק עם סליל גדול קוטר חימום, ולא חוט חימום, יש צורך. פיפטה multibarrel צריכה להיות מוכנסת במרכז חוט החימום עם no לפנות לסליל החימום. שימו לב שמלבד את pipettes 5-החבית מתוארת כאן, 3-חבית או החבית 7 pipettes חלופות מסחריות זמינות. משוך זכוכית לקצה פיפטה של ​​כ 10 מיקרומטר קוטר כולל, או פחות. טיפ יהיה שבור לקוטר הנכון בשלב הבא, כך שגודל הטיפ המדויק הוא פחות קריטי בתהליך מושך מהצורה הכללית של קצה האלקטרודה, שאמורה להיות ארוך ודק יחסית. עיין בתמונה באיור 1C לצורת קצה האלקטרודה הרצויה. צורות אלקטרודה קצרות ועבות (האיור 1B) תגרומנה לכמות משמעותית של ניזק לרקמה, כאשר התקדמו לתוך המוח, ואילו צורות אלקטרודה ארוכות מאוד ודקות (איור 1 א) תהיינה לכופף ובכך תהפוכנה את זה קשה לשבור את קצה האלקטרודה לנכונה קוטר (ראה שלב 2). שנה טיפי אלקטרודה שנה טיפי אלקטרודות. לפני שתי אלקטרודות יכולות להיות מודבקות יחד, הם צריכים להיות שונים. הפיר של האלקטרודה היחידה צריך להיות כפוף לפני זה יכול להיות מחובר לmultibarrel לוודא הפיר המשולב של האלקטרודה המוגמרת חזירון הגב הוא דק ככל האפשר. בנוסף, קצה האלקטרודה multibarrel יש לשבור את כדי להבטיח עמידות נמוכה לiontophoresis. כופף את המוט של האלקטרודה חבית אחת של כ 20 מעלות. השתמש להבת בונזן המבער הקטנה ביותר האפשרית. מבערים טיפוסיים "קטנים" בונזן מחברות אספקת מעבדה הרגילות ליצור גדלי להבה, כי הם גדולים מדי עבור יישום זה. כדי לעקוף בעיה זו להשתמש במבער בונזן המסחרי הקטן ביותר ולהבטיח את מחט מזרק (~ 18 מד) לראש המבער, ולאטום את החיבור באמצעות מלט שיניים. כאשר מופעלים, הלהבה צריכה להיות קשה לראות, בערך 5 מ"מ או פחות בקוטר, וכ 8 מ"מ גבוה. כל תנועת האוויר בחדר תהיה לכבות אש ש, כך שזה רעיון טוב לפעול בצורבחדר סגור, או להשתמש במגן רוח. העבר את האלקטרודה חבית אחת דרך הלהבה כדי לכופף אותו בכ 20 מעלות. שואף להיות להבת המבער ממסה את הזכוכית באזור המעבר בכ 10 מילימטרים ספורים מקצה האלקטרודה. כדי למנוע התכת קצה האלקטרודה אנו מציעים שנתקיים באלקטרודה על 45 מעלות, קצה כלפי מטה, ולהזיז את האלקטרודה דרך הלהבה במהירות יחסית. לשבור את קצה האלקטרודה multibarrel. כדי להבטיח בקרה חזותית תוך שבירת קצה האלקטרודה, השתמש במיקרוסקופ במטרת 10x מינימום וoculars 10x. היקף מדידה מוכנס העיני יהיה גם צורך למדוד גדלי טיפ. צרף חתיכת פרספקס למיקרוסקופ כזה שסופו של פרספקס ניתן לראות כבשליש למחצית משדה הראייה של המיקרוסקופ. במקרה שלנו, חתיכת פרספקס היא כ 70 מ"מ x 25 מ"מ עובי ו 5 ומחובר באמצעות בורג שיכול להיות מאובטח למנהגעשה נושא בשלב מיקרוסקופ. חשוב יש עיצוב שמאפשר לפרספקס נע באופן עצמאי של השקופית. הנח את האלקטרודה multibarrel במיטה של ​​פלסטלינה בשקופית זכוכית, ולהכניס את השקופית המכילה את האלקטרודה לתוך החזיק השקופיות של במת מיקרוסקופ. שימוש המניפולטורים XY של במת מיקרוסקופ, בעדינות להזיז את קצה האלקטרודה נגד חתיכת פרספקס, ולבחון את השבירה של הקצה דרך oculars המיקרוסקופ. תנסה נקי כדי לשבור הקצה של multibarrel לקוטר מצטבר של כ 25-35 מיקרומטרים. השלך pipettes עם קוטר טיפ שפרץ את גדול מדי, או טיפים עם הפסקות לא אחידות. אנחנו זורקים כ 30% מאלקטרודות multibarrel בשל צורות עצה לא רצויות. להרכיב אלקטרודה פיגי גב להרכיב האלקטרודה חזירון גב. אלקטרודות עמדה. הסרת חתיכת פרספקס משמשת בשלב 2.2 מבמת מיקרוסקופ. Secure השליםmultibarrel האלקטרודה לפלסטלינה בשקופית זכוכית, עצה מצביעה מעט כלפי מעלה. מצביע כלפי מעלה יהיה חשוב עבור צעד 3.2, ההדבקה של שתי אלקטרודות. טיפים שמצביעים בעד לגרום לדבק לברוח מהקצה, הימנעות הדבקת קצות אלקטרודות. הכנס האלקטרודה חבית אחת כפופה למחזיק האלקטרודה של micromanipulator בהתאמה האישי (איור 2). השימוש הראשון ולאחר מכן הדרכה חזותית הנחיה מיקרוסקופית, להנמיך את האלקטרודה חבית אחת על האלקטרודה multibarrel. אלקטרודה הבודדה לא צריכה להיות וריד ישירות לתוך החריץ שנוצר על ידי הסידור של 5 חביות, בקצו הבולט בקצה של קצה multibarrel כ מיקרומטרים 5-10. כאשר מורידים את החבית אחת, עוקב בקפידה אחרת הזווית שנוצרת בין שתי אלקטרודות. לתוצאה הטובה ביותר להימנע מכל זוויות שבקצוות להצביע בנפרד אחד מהשני, אלא מנסים להנמיך את האלקטרודה אחת על רב בצורה מושלמת במקביל או אפילו בקצונגיעת multibarrel הראשון, ויצר הסדר "טריז" קל מאוד. מאז את קצה חבית אחת הוא מאוד גמיש, הוא מתכופף כאשר האלקטרודה היחידה היא הורידה עוד קצת אחרי הקצה הגיע המשטח העליון של האלקטרודה החבית הרבה, ויוצר קצה משולב נקי שיש כמות קטנה של פעולת מעיין נבנתה ב המסייע להחזיק את העצות ביחד. עם זאת, אם הזווית בין חבית אחת ואלקטרודה multibarrel היא תלולה מדי (יותר מדי של טריז), שהקפיץ יהיה גבוה מדי ולכופף את מטה הסדר אלקטרודות. פירי דבק אלקטרודה יחד. דבקים בפירים של שתי אלקטרודות יחד באמצעות cyanoacrylate (דבק מגע). הנח טיפה קטנה של דבק על הצד הקטן של קיסם שטוח והרכבת האלקטרודה מגע עם טיפת הדבק. התחל במיקום המרוחק ביותר של העצות ולהעביר קיסם לאט עם טיפת דבק לאורך פירים אלקטרודה כלפי טיפי אלקטרודות. שימוש יותר מדי דבק, או החלת דבק לאoo קרוב לטיפים אלקטרודה יגרום הדבקת פתחי אלקטרודה, טיוח האלקטרודה לפחות חלקית מתפקד. לייצב משותף עם מלט שיניים. מערבבים כמות קטנה של מלט שיניים ואקריליק שיניים בצלחת פלסטיק חד פעמית קטנה או שוקל סירה, באמצעות קיסם שטוח. חכה עד מלט הופך moldable ולהחיל כמות קטנה למפרק בין שתי אלקטרודות מנת לייצב את המפרק (חומר ורוד באיור 3). אפשר כ 15 דקות לייבוש. הסר ולאחסן אלקטרודה. להסיר בזהירות את האלקטרודה חזירון הגב סיים ראשון מבעל micromanipulator, ולאחר מכן לנתק אותה מהזכוכית השקופית, וחנות במכל dustproof. הכן את פתרוני אלקטרודה מילוי הכן את האלקטרודה פתרוני מילוי. מאז iontophoresis דורש מולקולות טעונות, רוב הסוכנים צריכים להיות מומסים או בסביבת חומצית או בסיסית (בדרך כללta-pH של כ 3-4, או pH של כ 8-10, בהתאמה). מספר הכימיקלים המשמשים לעתים קרובות בiontophoresis מופיעים בטבלת 1. לסוכנים שאינם מופיעים בטבלה, לקבוע מערך PKA, בין אם זה יהיה קל יותר לשימוש במולקולה חומצית או סביבה בסיסית כדי לשמור על המולקולה טעונה, ולפזר בהתאם. לקבלת תוצאות הטובות ביותר, מערבב את כל הפתרונים טריים מדי יום. מלא והכן אלקטרודות מלא ולהכין אלקטרודות. רק לפני השימוש באלקטרודה, גב למלא כל חבית עם התרופה המתאימה, באמצעות סיבי פחם 28-34 מחטי מד מחוברים למזרקים עם מסנני מזרק. מלא את 4 חביות החיצוניות של התצורה 5-החבית עם תרופות של בחירה, וחבית מרכז עם 3M NaCl כחבית איזון. מלא את האלקטרודה הקלטת חבית אחת עם 3M NaCl גם כן. הוספת צבע לפתרון NaCl, כגון אדום ירוק או פנול מהיר תקל לראות קצה האלקטרודהבמהלך ההשמה של האלקטרודה על משטח המוח. הכנס את האלקטרודה לתוך מחזיק האלקטרודה של הגדרת ההקלטה ולהכניס את כל החוטים לתוך חביות הזכוכית המתאימות. השתמש בחוט כסף מבודד ממנו כ 1 הסנטימטר של בידוד הוסר בקצה. לא צריך להיות 5 חוטים לאלקטרודה multibarrel (4 חביות סמים וחבית איזון 1), בתוספת חוט המגבר שצריך להיות מוכנסים לתוך חבית האלקטרודה הקלטה האחת. הפעל מודולים משאבת Iontophoresis הפעל מודולים משאבת iontophoresis ולבדוק את כל החביות. פונקצית בדיקת האלקטרודה של כל מודול משאבה תעזור לקבוע אם חבית אלקטרודה היא פונקציונלית. כדי למנוע דליפה של תרופות מהחביות כשאינן בשימוש, מתח שייר בקוטביות ההפוכה כאחראי המולקולה צריך להיות מיושם.