דימות אופטי לא פולשנית של כלי דם הלימפה של עכבר
Summary
שיטות הדמיה שפותחו לאחרונה באמצעות פלואורסצנטי קרוב אינפרא אדום (NIRF) עשויות לעזור להבהיר את תפקיד מערכת הלימפה משחקת בהתפשטות גרורה סרטני, תגובה חיסונית, תיקון פצע, ומחלות אחרות הקשורים לימפטי.
Abstract
מערכת כלי דם הלימפה היא מרכיב חשוב של מערכת הדם ששומר על איזון נוזלים, מספקת מעקב חיסוני, ומתווך ספיגת שומן במעיים. ואולם, למרות הפונקציה הקריטית שלו, יש הבנה מועטת יחסית מאיך מערכת הלימפה מסתגלת לשרת פונקציות אלה במחלה ובריאות 1. לאחרונה, יש לנו הפגנתי יכולת ארכיטקטורה דינמית תמונת הלימפה והלימפה פעולה "שאיבה" בבני אדם רגילים, כמו גם באנשים הסובלים תפקוד הלימפה באמצעות ממשל זכר לצבע קרוב אינפרא האדום ניאון (NIRF) ומותאם אישית, Gen-III התעצם מערכת הדמיה 2-4. NIRF ההדמיה הראתה שינויים דרמטיים בארכיטקטורת הלימפה ולתפקד עם מחלה אנושית. עדיין לא ברור כיצד השינויים הללו מתרחשים ומודלים של בעלי חיים חדשים מפותחים כדי להבהיר בסיס הגנטי ומולקולרי שלהם. בפרוטוקול זה, אנו מציגים הלימפה NIRF, שלקניון חית הדמית 5,6 באמצעות indocyanine ירוק (ICG), צבע ששמש במשך 50 שנים בבני אדם 7, ותחום NIRF צבע הכותרת מחזורי אלבומין מחייב (CABD-IRDye800) פפטיד שנקשר מעדיפים עכבר ו8 אלבומין אנושיים . כ 5.5 פעמים בהירות יותר ICG, CABD-IRDye800 יש פרופיל אישור הלימפה דומה וניתן להזריק במינונים נמוכים יותר מאשר ICG להשיג אותות NIRF מספיקים להדמיה 8. מכיוון שגם לאגד CABD IRDye800-ICG ולאלבומין במרחב הבין 8, שניהם יכולים לתאר תחבורת חלבונים פעילה אל ובתוך lymphatics. Intradermal (ID) זריקות (μl 5-50) של ICG (645 מיקרומטר) או CABD-IRDye800 (200 מיקרומטר) בסליין מנוהלות להיבט הגבי של כל רגלו האחורית ו / או בצד ימין והשמאל של הבסיס זנב של עכבר isoflurane-מורדם. ריכוז צבע וכתוצאה מכך הוא בעלי החיים 83-1,250 מיקרוגרם / ק"ג לICG או 113-1,700 מיקרוגרם / ק"ג עבורCABD-IRDye800. מייד לאחר זריקות, הדמיה תפקודית הלימפה מתבצעת לתקופה של עד 1 שעה באמצעות מערכת מותאמת אישית, חיות קטנה NIRF הדמיה. רזולוציה מרחבית חיים שלמה יכולה לתאר את כלי ניאון הלימפה של 100 מיקרון או פחות, ותמונות של מבנים ל3 סנטימטרי עומק ניתן לרכוש 9. תמונות נרכשה באמצעות V + + תוכנה ונותחה באמצעות ImageJ או תוכנת MATLAB. במהלך ניתוח, אזורים רצופים של ריבית (Rois) המקיפה את קוטר הכלי כולו נמשכים לאורך כלי הלימפה נתונה. הממדים עבור כל ROI נשמרים קבוע לכלי נתון ועוצמת NIRF נמדד עבור כל ROI כמותית להעריך "מנות" של הלימפה עוברת דרך כלי דם.
Protocol
Representative Results
Discussion
אנו משתמשים במערכה אישית, חיות קטנה NIRF הדמיה כדי ללכוד תמונות של כלי הלימפה שכותרתו בעכברים. לבנות סרטים של תנועת הלימפה, 300 או יותר תמונות שנאספו. לניתוח פונקציונלי של lymphatics מסרטים, שתיים או יותר Rois מצויר ידני יחד כלי הלימפה. מידותיו של Rois נשמרות קבועה לכל כלי והן כ הק?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי המענקים הבאים לאוות Sevick: NIH R01 CA128919 וNIH R01 HL092923.
Materials
| Solutions, Reagents, and Equipment | Company | Catalog Number | Comments |
| Indocyanine green (ICG) | Patheon Italia S.P.A. | NDC 25431-424-02 | Reconstitute to 645 μM (5 μg/10 μL) |
| Cyclic Albumin Binding Domain(cABD) | Bachem | Custom | Reconstitute to 200 μM (6.8 μg/10 μL) |
| IRDye800 | Li-COR | IRDye 800CW | Reconstitute according to manufacture’s instructions; conjugate with cABD at equilmolar concentrations |
| Sterile Water | Hospira, Inc., Lake Forest, IL | NDC 0409-4887-10 | |
| NAIR | Church & Dwight Co., Inc. | Local Stores | www.nairlikeneverbefore.com |
| Imaging System (components below) | Center for Molecular Imaging | N/A | Custom-built in our laboratories. |
| Electron-multiplying charge-coupled device (EMCCD) camera | Princeton Instruments, Trenton, NJ | Photon Max 512 | |
| Nikon camera lens | Nikon Inc., Melville, NY | Model No. 1992, Nikkor 28mm | |
| Optical filter | Andover Corp., Salem,NH | ANDV11333 | Two 830.0/10.0 nm bandpass filters are used in front of lens |
| 785-nm laser diode | Intense Ltd, North Brunswick, NJ | 1005-9MM-78503 | 500 mW of optical output |
| Collimating optics | Thorlabs, Newton, NJ | C240TME-B | Collimates laser output prior to cleanup filter |
| Clean-up filter | Semrock, Inc., Rochester, NY | LD01-785/10-25 | Removes laser emission in fluorescence band |
| Optical diffuser | Thorlabs, Newton, NJ | ED1-C20 | Diffuses the laser over the animal |
| V++ | Digital Optics, Browns Bay, Auckland, New Zealand | Version 5.0 | Software used to control camera system and save images to computer. http://digitaloptics.net/ |
| Analytic Software Either of the following software packages can be used for image analysis | |||
| ImageJ | National Institutes of Health, Bethesda, MD | Most current version available | Freeware available at http://rsbweb.nih.gov/ij/ |
| MATLAB | MathWorks, Natick, MA | Version 2008a or later | http://www.mathworks.com/ |
References
- Alitalo, K. The lymphatic vasculature in disease. Nat. Med. 17, 1371-1380 (2011).
- Rasmussen, J. C., Tan, I. C., Marshall, M. V., Fife, C. E., Sevick-Muraca, E. M. Lymphatic imaging in humans with near-infrared fluorescence. Curr. Opin. Biotechnol. 20, 74-82 (2009).
- Rasmussen, J. C., et al. Human Lymphatic Architecture and Dynamic Transport Imaged Using Near-infrared Fluorescence. Transl. Oncol. 3, 362-372 (2010).
- Sevick-Muraca, E. M. Translation of near-infrared fluorescence imaging technologies: emerging clinical applications. Annu. Rev. Med. 63, 217-231 (2012).
- Kwon, S., Sevick-Muraca, E. M. Noninvasive quantitative imaging of lymph function in mice. Lymphat. Res. Biol. 5, 219-231 (2007).
- Kwon, S., Sevick-Muraca, E. M. Mouse phenotyping with near-infrared fluorescence lymphatic imaging. Biomed Opt Express. 2, 1403-1411 (2011).
- Marshall, M. V., et al. Near-infrared fluorescence imaging in humans with indocyanine green: a review and update. The Open Surgical Oncology Journal. 2, 12-25 (2010).
- Davies-Venn, C. A., et al. Albumin-Binding Domain Conjugate for Near-Infrared Fluorescence Lymphatic Imaging. Mol. Imaging Biol. , (2011).
- Sharma, R. Quantitative imaging of lymph function. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 292, 3109-3118 (2007).
- Kwon, S., Sevick-Muraca, E. M. Functional lymphatic imaging in tumor-bearing mice. J. Immunol. Methods. 360, 167-172 (2010).
- Karlsen, T. V., McCormack, E., Mujic, M., Tenstad, O., Wiig, H. Minimally invasive quantification of lymph flow in mice and rats by imaging depot clearance of near-infrared albumin. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 302, 391-401 (2012).
- Zhou, Q., Wood, R., Schwarz, E. M., Wang, Y. J., Xing, L. Near-infrared lymphatic imaging demonstrates the dynamics of lymph flow and lymphangiogenesis during the acute versus chronic phases of arthritis in mice. Arthritis Rheum. 62, 1881-1889 (2010).
- Adams, K. E., et al. Direct evidence of lymphatic function improvement after advanced pneumatic compression device treatment of lymphedema. Biomed. Opt. Express. 1, 114-125 (2010).
- Tan, I. C., et al. Assessment of lymphatic contractile function after manual lymphatic drainage using near-infrared fluorescence imaging. Arch. Phys. Med. Rehabil. 92, 756-764 (2011).
- Lapinski, P. E., et al. RASA1 maintains the lymphatic vasculature in a quiescent functional state in mice. J. Clin. Invest. 122, 733-747 (2012).
- Maus, E. A., et al. Near-infrared fluorescence imaging of lymphatics in head and neck lymphedema. Head Neck. 34, 448-453 (2012).
- Galanzha, E. I., Tuchin, V. V., Zharov, V. P. Advances in small animal mesentery models for in vivo flow cytometry, dynamic microscopy, and drug screening. World J. Gastroenterol. 13, 192-218 (2007).
- Schramm, R., et al. The cervical lymph node preparation: a novel approach to study lymphocyte homing by intravital microscopy. Inflammation research : official journal of the European Histamine Research Society. 55, 160-167 (2006).
- Hall, M. A., et al. Imaging prostate cancer lymph node metastases with a multimodality contrast agent. Prostate. 72, 129-146 (2012).
- Zhu, B., Sevick-Muraca, E. M. Minimizing excitation leakage and maximizing measurement sensitivity for molecular imaging with near-infrared fluorescence. J. Innovat. Opt. Health Sci. 4, 301-307 (2011).
