عزل تدفق Cytometric من نوع خلايا الفئران الابتدائية السنخية II طلائي للدراسات الوظيفية والجزيئية
Summary
وصفنا عزل الخلايا الأولية السريع للنوع الثاني الفئران السنخية الظهارية (وادي) عن طريق الانتقاء السلبي تدفق cytometric. هذه تظهر قابلية عالية وادي والنقاء ومناسبة لمجموعة واسعة من الدراسات الفنية والجزيئية بشأن دورها في أمراض الجهاز التنفسي مثل أمراض المناعة الذاتية أو المعدية.
Abstract
على مر السنين الماضية، مساهمة الخلايا السنخية نوع II الظهارية (وادي) لمختلف جوانب تنظيم المناعة في الرئة باعتراف متزايد. وقد ثبت للمشاركة في وادي إنتاج السيتوكينات في القصبات الهوائية الملتهبة والعمل حتى مع مستضد تقديم الخلايا في كل من العدوى والمناعة الذاتية خلايا T بوساطة 1-8. ولذلك، فهي مثيرة للاهتمام لا سيما أيضا في سياقات السريرية مثل التفاعل المفرط لمجرى الهواء والأجنبية المستضدات الذاتية وكذلك الإصابات التي تستهدف مباشرة أو غير مباشرة وادي. ومع ذلك، فإن فهمنا لوظائف المناعية مفصلة خدم وفقا لنوع الخلايا السنخية II الظهارية في رئة سليمة وكذلك في التهاب يبقى مجزأ. يتم تنفيذ العديد من الدراسات المتعلقة باستخدام الماوس وادي ظيفة أو السنخية الإنسان خطوط الخلايا الظهارية 9-12. العمل مع خطوط الخلايا يوفر بالتأكيد مجموعة من المزايا، مثل توافر أعداد كبيرة سو خلايا لتحاليل واسعة النطاق. ومع ذلك، فإننا نعتقد أن استخدام الفئران وادي الابتدائية يسمح فهم أفضل لدور هذه نوع من الخلايا في العمليات المعقدة مثل العدوى أو التهاب المناعة الذاتية. يمكن عزل وادي الفئران الأولية مباشرة من الحيوانات تعاني من أمراض الجهاز التنفسي مثل هذه، وهذا يعني أنها كانت تخضع لعوامل خارجي إضافية عن لعب دور في الإعداد تحليلها. وعلى سبيل المثال، يمكن عزل وادي قابلة للحياة من الفئران المصابة بفيروس A الأنف الأنفلونزا، الذي يستهدف في المقام الأول هذه الخلايا للنسخ المتماثل 13. الأهم من ذلك، من خلال عدوى فيفو السابقين من وادي معزولة عن الفئران السليمة، ويمكن للدراسات التي شنت على الاستجابات الخلوية العدوى مزيد الموسعة.
ويستند لدينا بروتوكول لعزل وادي الفئران في المقام الأول على الهضم الأنزيمي في الرئة الماوس تليها وصفها لتعليق الخلية الناتج مع الاجسام المضادة المحددة لCD11c، CD11b، F4/80،CD19، CD45 وCD16/CD32. ثم يتم تحديد وادي حبيبي ومبعثر وغير المسماة sideward عالية (SSC عالية) السكان الخلية والخلية تكون مفصولة المنشط مضان الفرز 3.
بالمقارنة مع طرق بديلة لعزل الخلايا الظهارية الأولية من الرئتين الماوس، لدينا لعزل بروتوكول تدفق cytometric من وادي ينتج عن طريق الانتقاء السلبي لم يمسها، وادي قابلة للحياة عالية ونقية في وقت قصير نسبيا. بالإضافة إلى ذلك، وعلى النقيض من الاساليب التقليدية في العزلة من قبل بالغسل واستنزاف الخلايا الليمفاوية عن طريق ربط الأجسام المضادة من جانب الخرز المغناطيسي 14 و 15، وتدفق الخلايا cytometric الفرز يسمح التمييز عن طريق حجم الخلية ومستوى. بالنظر إلى أن الأجهزة للفرز تدفق خلية cytometric متاح، يمكن تطبيق الإجراءات الموصوفة بتكاليف منخفضة نسبيا. بجوار الأجسام المضادة والأنزيمات القياسية للتفكك الرئة، لا الكواشف إضافية مثل المغناطيسيةويلزم الخرز. الخلايا المعزولة هي مناسبة لمجموعة واسعة من الدراسات الفنية والجزيئية، والتي تشمل المختبر في الثقافة والمقايسات تحفيز خلايا T وكذلك transcriptome، بروتيوم أو تحليلات secretome 3 و 4.
Protocol
Representative Results
Discussion
بروتوكول لدينا لعزل وادي الفئران بواسطة التدفق الخلوي يوفر وسيلة سريعة للوصول الخلايا الأولية من الرئة الماوس لمجموعة كاملة من الدراسات الفنية والجزيئية. وصف الإجراء ينتج السكان للغاية وقابلة للحياة نقية من وادي التي هي كافية في عدد لاحق لتحاليل مباشرة، مثل العزلة…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نود أن نشكر M. Höxter للمساعدة التقنية في وادي الفرز الأولية من عينات الفئران السلامة الأحيائية المستوى 2.
وأيد هذا العمل من المنح المقدمة من مؤسسة البحوث الألمانية (DFG) لDB (SFB587، B12 TP وBR2221/1-1) وراتبا من البحوث الطبية الحيوية هانوفر مدرسة (DFG GSC 108) إلى AA. ويدعم DB من مبادرة الرئيس الخاصة وصندوق شبكة من مؤسسة هيلمهولتس لمراكز الأبحاث الألمانية (HGF) تحت W2/W3-029 عدد العقد.
Materials
| Name of reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| indwelling cannula Introcan 22G | Braun | REF 4252098B | |
| Dispase, 100 ml(5000 caseinolytic units) | BD Biosciences | 354235 | aliquot to 4 ml in 15 ml tubes, store at -20 °C |
| Biozym Plaque Agarose | Biozym | 840101 | 1% w/v in H2O |
| Deoxyribonuclease I from bovine pancreas, 2000 Kunitz units/vial | Sigma-Aldrich | D4263 | freshly dissolve content of 1 vial in 300 μl DMEM |
| DMEM | Gibco | 22320-022 | used as provided by manufacturer (Low Glucose, Pyruvate, HEPES) |
| cell strainers (100 μm, 75 μm) | BD Falcon | 352360, 352350 | |
| nylon mesh(48 μm, 30 μm) | Bückmann GmbH | 03-48/26-1020, 03-30/18-108 | |
| CellTrics 50 μm filter | PARTEC | 04-0042-2317 | |
| anti-mouse CD16/CD32 | BioLegend | 101302 | clone 93; purified |
| anti-mouse F4/80 | BioLegend | 123116 | clone BM8; APC coupled |
| anti-mouse CD11b | BioLegend | 101208 | clone M1/70; PE coupled |
| anti-mouse CD11c | BioLegend | 117310 | clone N418; APC coupled |
| anti-mouse CD45 | BioLegend | 103102 | clone 30-F11; purified |
| anti-mouse CD19 | eBioscience | 12-0193-83 | eBio 1D3; PE coupled |
| polyclonal goat anti-rat IgG | BD Pharmingen | 550767 | polyclonal, PE coupled |
Antibodies coupled to alternative fluorochromes can be used, depending on the flow cytometer and lasers available. |
References
- Fehrenbach, H. Alveolar epithelial type II cell: defender of the alveolus revisited. Respir. Res. 2, 33-46 (2001).
- Folkerts, G., Nijkamp, F. P. Airway epithelium: more than just a barrier. Trends Pharmacol. Sci. 19, 334-341 (1998).
- Gereke, M., et al. Phenotypic alterations in type II alveolar epithelial cells in CD4+ T cell mediated lung inflammation. Respir. Res. 8, 47 (2007).
- Gereke, M., Jung, S., Buer, J., Bruder, D. Alveolar type II epithelial cells present antigen to CD4(+) T cells and induce Foxp3(+) regulatory T cells. Am. J. Respir. Crit Care Med. 179, 344-355 (2009).
- Gribar, S. C., Richardson, W. M., Sodhi, C. P., Hackam, D. J. No longer an innocent bystander: epithelial toll-like receptor signaling in the development of mucosal inflammation. Mol. Med. 14, 645-659 (2008).
- Herold, S., et al. Alveolar epithelial cells direct monocyte transepithelial migration upon influenza virus infection: impact of chemokines and adhesion molecules. J. Immunol. 177, 1817-1824 (2006).
- Knight, D. A., Holgate, S. T. The airway epithelium: structural and functional properties in health and disease. Respirology. 8, 432-446 (2003).
- Schmiedl, A., Kerber-Momot, T., Munder, A., Pabst, R., Tschernig, T. Bacterial distribution in lung parenchyma early after pulmonary infection with Pseudomonas aeruginosa. Cell Tissue Res. 342, 67-73 (2010).
- Loveday, E. K., Svinti, V., Diederich, S., Pasick, J., Jean, F. Temporal- and Strain-Specific Host MicroRNA Molecular Signatures Associated with Swine-Origin H1N1 and Avian-Origin H7N7 Influenza A Virus Infection. J. Virol. 86, 6109-6122 (2012).
- Marriott, H. M., et al. Interleukin-1beta regulates CXCL8 release and influences disease outcome in response to Streptococcus pneumoniae, defining intercellular cooperation between pulmonary epithelial cells and macrophages. Infect. Immun. 80, 1140-1149 (2012).
- Mata, M., Morcillo, E., Gimeno, C., Cortijo, J. N-acetyl-L-cysteine (NAC) inhibit mucin synthesis and pro-inflammatory mediators in alveolar type II epithelial cells infected with influenza virus A and B and with respiratory syncytial virus (RSV). Biochem. Pharmacol. 82, 548-555 (2011).
- Zarbock, R., et al. The surfactant protein C mutation A116D alters cellular processing, stress tolerance, surfactant lipid composition, and immune cell activation. BMC. Pulm. Med. 12, 15 (2012).
- Taubenberger, J. K., Morens, D. M. The pathology of influenza virus infections. Annu. Rev. Pathol. 3, 499-522 (2008).
- Dobbs, L. G. Isolation and culture of alveolar type II cells. Am. J. Physiol. 258, L134-L147 (1990).
- Corti, M., Brody, A. R., Harrison, J. H. Isolation and primary culture of murine alveolar type II cells. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 14, 309-315 (1996).
- Beers, M. F., Kim, C. Y., Dodia, C., Fisher, A. B. Localization, synthesis, and processing of surfactant protein SP-C in rat lung analyzed by epitope-specific antipeptide antibodies. J. Biol. Chem. 269, 20318-20328 (1994).
- Phelps, D. S., Floros, J. Localization of pulmonary surfactant proteins using immunohistochemistry and tissue in situ hybridization. Exp. Lung Res. 17, 985-995 (1991).
- Wang, J., et al. Differentiated human alveolar type II cells secrete antiviral IL-29 (IFN-lambda 1) in response to influenza A infection. J. Immunol. 182, 1296-1304 (2009).
- Wang, J., et al. Innate immune response to influenza A virus in differentiated human alveolar type II cells. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 45, 582-591 (2011).
