의 혈소판 응집 중재를위한 간단한 프로토콜<em> 변형체 falciparum의</em자원별로 설정에서> - 감염된 적혈구

1. 시료 채취 혈소판은 쉽게 온도, 교반 또는 스토리지를 통해 활성화 될 수 있으므로 그들은 조심스럽게 취급해야합니다. 혈소판 준비를위한 혈액을 수집 vacutainers의 사용은 대부분의 임상 상황에서 피할 수 있지만, 흡입 가능성이 혈소판 활성화를 일으킬 수 있으므로 신중하게 고려되어야한다. 우리의 연구 병원에서 사용하는 임상 프로토콜로 인해, 우리의 견본을주의 깊게 구연산 나트륨 vacutainers에 수집됩니다. 우리는이 또는 우리의 이전 연구 12 조기 혈소판 활성화에 대한 어떤 문제가 발생하지 않았습니다. 우리는 비특이적 혈액 그룹 항원 응집을 최소화하기 위해 혈액형 O + 개인의 혈소판 준비를위한 혈액을 수집합니다. 기증자는 또한 일부 약물은 혈소판 기능에 영향을 미치는 알려진대로 이전 7-10 일에서 약물을 촬영하지 않았습니다. 혈소판이 풍부한 혈장의 1.1 준비 (PRP) 약 5 mL를 수집CM 심한 말라리아 (SM) 구연산 나트륨 vacutainer 환자 (BD 제품 번호 36276)에서 말라리아 순진 호스트 또는 혈액의 2.5 ML에서 전혈. 실온에서 10 분 250 XG에서 전체 혈액을 원심 분리기. 낮은 온도가 집계 혈소판의 원인이 될 수 있습니다 ° C로 4에서 원심 분리하지 마십시오. 조심스럽게 깨끗한 15 ML 튜브에 흐린 뜨는을 전송합니다. 혈소판은 쉽게 온도 변화 및 물리적 충격에 의해 활성화되어 있으므로 취급에주의해야한다. 동요 또는 관의 육포 움직임을 피하십시오. > 300 혈소판 현탁액을 계산하고 조정 네우 바우의 haematocytometer을 사용하여 X 10 3 혈소판 / 건강한 기증자에 대한 μL와 <150 × 10 3 혈소판 / CM 및 1X 인산염 완충액 (pH가 7.2-7.4, PBS)를 사용하여 SM 환자에서 μL. 혈소판을 완화하고 정확성을 보장하기 위해 높은 희석 배수를 선택해야합니다. 참고 : 말라리아 퍼트의 ients는 건강한 개인 16,17,18에 비해 감소 된 혈소판 수 있습니다. CM 및 UM에 대한 그러므로 혈소판 농도는 각 말라리아 진단 그룹 내에서 환자의 평균 혈소판 수에 따라 조정됩니다. P. falciparum의 응집 표현형 CM 균주에서 흔히 혈소판 농도가 모든 CM의 경우 표준화되어 있기 때문에 덩어리의 크기 나 빈도에 영향을주지 않는 강한 결합력 때문에 감소 된 혈소판 농도를 표시합니다. 혈소판 가난한 플라즈마의 1.2 준비 (PPP) PPP를 얻으려면, 10 분 1,500 XG에서 위에서 얻은 PRP의 일부를 원심 분리기. 혈소판의 대부분은 튜브의 바닥에 침전이다. PRP와 PPP 모두 최대 2 주에 대해 4 ° C에 저장할 수 있습니다. 이상적으로, 응집 분석을 위해 신선한 혈소판을 사용합니다. 8-10일 후 혈소판의 대부분은 비활성 아마 집계 될 가능성이 있습니다. 2. 항ITE 문화 5 분 370 XG에서 원심 분리하여 5-10 ML RPMI 1640 펠렛 pRBC 세 번 씻으십시오. 참고 :이 프로토콜의 모든 문화가 약​​ 1 ML 포장 세포 볼륨 (PCV)에서 시작하고 5 %의 용적률로 유지. 문화는 pRBC의 PCV 시작하고 원하는 혈소판에 도달하는 감염되지 않은 RBC와 미디어를 적절하게 조정할 수 있습니다. 25 MM의 HEPES, 5 % Albumax II 또는 10 %의 혈청 및 40 ㎍ / 5 % 용적률을 달성하기 위해 ML의 젠타 마이신과 보충 RPMI 1640 표준 말라리아 배지와 배양 플라스크 보충 pRBC를 놓습니다. 씰링 및 배양하기 전에 92.5 %의 질소, 2.5 % 산소와 5 % 이산화탄소의 혼합과 문화 플라스크를 침투. 또한, Trager-젠슨의 빵빵한 촛불 항아리 방법을 사용할 수 있습니다. pRBC 환자로부터 직접 획득을 위해, 성숙한 기생충을 얻기 위해 5 % CO 2에서 37 ° C 배양기에서 24-36 시간 동안 그들의 문화 플라스크를 품어. 참고 : MOST 실험실과 문화 적응 라인은 표준 조건 하에서 문화를 유지하는 것은 매우 쉽습니다. 성장률을 유지하기 위해 다른 기생충 단계를 동기화하는 데 사용할 수있는 아래에 설명 된 간단한 기술이 있습니다. 아래에 설명 된대로가는 혈액 얼룩을 준비하고 광학 현미경으로 기생충 성숙을 검사합니다. 3. 얇은 피 필름 슬라이드 준비 평평한 표면에 쉬고 젖빛 유리 슬라이드의 한쪽 끝에서 혈액의 약 10 ~ 15 μl를 놓습니다. 혈액이 균등하게 두 번째 슬라이드의 가장자리에 분산 될 때까지 두 번째 슬라이드의 가장자리 혈액의 드롭을 누릅니다. 첫 번째 슬라이드에 너무 많은 압력을 발휘하지 않고, 신속하게 조심스럽게, 각도 45 °에서 두 번째 슬라이드를 누른 상태에서 균일하게 분산되어 혈액의 박막을 만드는 첫 번째 슬라이드에 걸쳐 혈액을 밀어 넣습니다. 건조한 공기. 10 초 동안 메탄올에 슬라이드를 찍어. 건조한 공기. 2 % Giemsa 성에서 슬라이드를 찍어적어도 10 분 동안 아인. 물이 나올 때까지 광범위하게 씻어 낸다. 건조한 공기. 가벼운 현미경 90 100X 오일 에멀젼 렌즈를 사용하여 슬라이드를 검사 4. 성별이 단계의 정제 및 동기화 성숙한 P.의 정화 falciparum의 pRBC는 응집 분석에 필요한 단계입니다. 실제로, 단지 성숙 기생충은 해당 리간드가 표현 감염된 적혈구의 표면에서 돌출되는이 수명주기 단계에로 혈소판 수용체에 결합 할 수있다. P.의 무성 단계를 정화하고 동기화하는 방법은 여러 가지가 있습니다 원충 : 늦은 무성 단계가 Percoll 기울기 19을 충실 할 수 있으며, 20 정렬 또는 젤라틴 침전 21 프로토콜을 사용하여 자기 세포는 여기에 설명.. 소르비톨 동기화는 (아무 N에 고리가 성숙 단계를 얻기 위해 24 ~ 26 시간 동안 배양 한 후, 링 단계 22으로 선택) 젤라틴 부양을 수행 할 EED. 4.1 Plasmagel의 부상 Plasmagel 부양은 밀도가 링 형태와 근엽이 바닥으로 가라 동안 낮은 무게 용액에 남아있는 적혈구를 혹 모양은 선택할 수있는 젤라틴과 같은 솔루션을 사용합니다. 이 기술은 성숙 단계에 감염된 적혈구의 90 % 순도를 포기하고 필드와 실험실 균주 모두에 사용할 수 있습니다. 그러나, 앞서 언급 plasmagel 부양은 rosetting pRBC뿐만 아니라 높은 rosetting 주파수와 그 샘플에서 감소 응집 주파수에서 발생할 수 미성숙 단​​계를 제거합니다. 응집은 혈소판에 의해 pRBCs 바인딩 매개하는 동안 rosetting이 pRBC과 감염되지 않은 적혈구의 상호 작용이기 때문에, plasmagel 부양 후 rosetting pRBC의 부재는 응집 분석에 영향을주지 않습니다. 이러한 두 가지 특성에 관련된 리간드는 다른, 주로 rosetting을 매개 감염되지 않은 적혈구의 수용체 CR-1을 보완와 함께. ° C의 물을 욕조에 37 Prewarm Gelofusine 솔루션 및 혈청 / Albumax II – 무료 매체. 5 분 370 XG에 실온에서 원심 분리하여 깨끗하고 멸균 15 ML 튜브 및 펠렛 세포에 문화를 전송할 수 있습니다. 조심스럽게 뜨는을 대기음하는만큼 Gelofusine과 단백질이없는 매체의 동일한 볼륨 펠렛과를 Resuspend 세포를 방해하지. 멸균 15 ML 튜브에 혼합물을 전송하고 명확한 경계가 상부와 하부 레벨 사이에 볼 수있을 때까지 37 ° C 배양기에서 15 ~ 20 분 동안이나 방치. 조심스럽게 신선한 멸균 15 ML 튜브에 상위 레이어를 전송하고 신선한 RPMI의 10 ML을 추가합니다. 5 분 370 XG에 원심 분리기 조심스럽게 상층 액을 버린다. 얇은 혈액 얼룩에 의해 parasitaemia 및 발달 단계를 평가하고 4 장에서 설명한대로 빛을 현미경으로 검사합니다. 참고 : 감염된 적혈구 dependi 60-90 % 범위 성숙한 pRBC 범위문화의 초기 parasitaemia에 NG. 성숙 기생충의 높은 비율을 위해, ≥ 10 %의 초기 parasitaemia와 문화를 사용합니다. 5. 분석을 응집 1 plasmagel 부상 후 얻은 pRBC 현탁액을 계산하고 조정 네우 바우의 haematocytometer을 사용하여 X 10 8 μL / pRBC. 신선한 1.5 ML 튜브에 20 ㎍ / 총 부피의 10 %에 ML 최종 농도와 PRP 5 %의 용적률, 아 크리 딘 오렌지에서를 Resuspend pRBC. 대신 크리 딘 오렌지, 기생충 문화는 사용하기 전에 5 분 동안 25 ㎍ / ㎖ ethidium의 브로마이드 물들 일 수 있습니다. 200 μL 반응 혼합을 위해 예를 들면, 10 μL 성숙한 pRBC, 300 X 10 3 혈소판 / 건강한 기증자 또는 150 × 10 3 혈소판 / SM 환자에서 μL 단백질이없는 배지 170 μL에서 PRP에 대한 μL의 20 μL를 추가합니다. 참고 : 혈소판의 비율 : pRBC 최종 반응에 20:1입니다. 격언이 허용되는이 중요합니다음 시료의 응집 주파수를 결정합니다. 적은 수의 혈소판이 컨트롤에 추가하는 경우 다음 모든 응집 pRBCs는 덩어리로 기회를 가질 수 없습니다. pRBCs의 응집에서 혈소판의 역할을 확인하기 위해 감염되지 않은 적혈구 세포와 PRP와 PPP와 pRBC, 같은 방법으로 다음 컨트롤을 준비합니다. 1.5-2.0 ML 원뿔 스크류 캡 병에 현탁액을 전송합니다. 실온에서 10 ~ 12 rpm으로 회전에 의해 교반에 따라 병을 놓습니다. 유리 미끄러 형광의 밑에 검사와 커버 pRBC의 10 μl를 피펫으로 제조 젖은 슬라이드 ± 유리 슬라이드에 혈소판 믹스 덩어리 형성을 확인합니다. 샘플링은 120 분의 총 15 ~ 20 분 간격으로 수행 할 수 있습니다. 덩어리가 세 개 이상의 감염된 적혈구의 집계로 간주됩니다.