一个简单的协议介导的血小板聚集<em>恶性疟原虫</em>受感染的红细胞在一个资源匮乏的设置

1。样品采集血小板可以很容易地通过激活温度，搅拌或存储，因此，他们应该小心处理。使用真空采血管收集血液血小板制剂在大多数临床情况是不可避免的，但应慎重考虑吸可能会导致血小板活化。由于我们的研究医院的临床使用的协议，我们的样本都是经过精心收集柠檬酸钠真空采血管。我们没有遇到任何问题，在我们以前的研究12血小板活化过早。我们收集血液血型O +个人血小板制剂，以尽量减少非特异性血型抗原聚集。捐助者也没有采取一些药物是众所周知的影响血小板功能的前7-10天用药。 1.1制备富血小板血浆（PRP） 收集约5毫升的从疟疾天真的主机或2.5毫升的血液从CM或严重的疟疾（SM）患者中的柠檬酸钠真空采血管（BD产品编号36276）的全血。 离心的全血在250×g离心10分钟，在室温下。不要离心，在4℃下，因为低温可能会导致血小板聚集。 小心转移上清在一个干净的15毫升管多云血小板由于温度变化和物理冲击，很容易被激活，因此，应谨慎处理。避免摇动或任何生涩的动作管。 使用一个纽鲍尔haematocytometer的计算和调整血小板悬液> 300×10 3血小板/μl的健康献血者和<150×10 3 CM使用1X磷酸盐缓冲液（pH值7.2-7.4; PBS）和SM患者的血小板/微升。请一定要选择一个高的稀释倍数，以缓解血小板计数，并确保其准确性。 注：疟疾拍拍的ients有血小板数量减少相比健康个人16,17,18。因此，血小板浓度为CM和UM根据为每个疟疾诊断组患者在血小板计数平均调整。 P.疟原虫丛生的表型是常见的在CM菌株和会表现出极强的亲和力，因此，降低血小板的浓度不影响丛大小或频率，因为血小板浓度是标准化的所有CM案件。 1.2制备贫血小板血浆（PPP） 若要取得PPP，离心10分钟以上获得1500 XG覆检委员会的部分。大多数的血小板沉淀在试管底部的。 PRP和PPP都可以储存在4℃长达两个星期。在理想的情况下，使用新鲜血小板结块检测。后8-10天血小板可能处于无效状态，可能凝集。 2。帕拉斯ITE文化颗粒PRBC三次洗净用5-10毫升的RPMI 1640中，通过离心分离，在370×g离心5分钟。 注：在本协议中所有的文化开始从约1毫升红细胞压积（PCV），并维持在5％的血细胞比容。文化可以开始PRBC任何PCV与未感染的红细胞和媒体并作相应调整，以达到所需的血细胞比容。 将PRBC在培养烧瓶中，并与标准的疟疾用25mM HEPES，5％Albumax II或10％血清和40微克/毫升庆大霉素，实现了5％的血细胞比容补充的RPMI 1640培养基补充。 渗透物与92.5％的氮，2.5％的氧气和5％二氧化碳的混合物中的培养瓶中密封前和孵化。另外，气密蜡烛罐Trager的Jensen的方法都可以使用。 对于PRBC由病人直接获得，孵化24-36小时，在37℃培养箱中培养瓶中，5％的CO 2，以获取成熟的寄生虫。 注：MOST实验室和文化适应的线是很容易保持在标准条件下的文化。有下面描述的简单的技术，可用于同步不同的寄生虫阶段保留生长速率。 准备薄血涂片（如下文所述），并在光学显微镜下检查寄生虫成熟。 3。薄血片玻片制备将约10-15微升血液磨砂载玻片上搁放在平坦的表面的一端上。 直至血被均匀地分布在第二滑动的边缘的边缘的第二滑动触摸滴血。 按住第二张幻灯片，在45°角，很快，但轻轻地，第一张幻灯片上没有施加太多的压力，将血液跨越的第一张幻灯片，使薄膜均匀分布的血液。空气干燥。 浸幻灯片甲醇10秒。空气干燥。 在2姬姆萨％ST浸幻灯片艾因至少10分钟。广泛冲洗，直到水运行明确。空气干燥。 检查幻灯片使用90-100X油乳剂镜头，光学显微镜上 4。无性阶段的纯化和同步的纯化的成熟的P。恶性 PRBC结块检测是必需的步骤。事实上，只有成熟的寄生虫能够结合血小板受体，因为它是在这个生命周期阶段的相关配体的表达和从感染的红细胞的表面突出。有几种方法以纯化并同步的P的无性阶段恶性疟原虫。：晚无性阶段可以丰富Percoll梯度19，磁性细胞分选20或使用明胶沉淀21协议的描述在这里。山梨糖醇同步选择的环台22，在这之后的环培养24-26小时，以获得成熟的阶段（与没有NEED执行明胶浮选）。 4.1 Plasmagel浮选 Plasmagel浮选使用明胶样的解决方案，选择较低的重量把手形红细胞留在溶液中，而密集的环形式和花环沉底。此技术提供了高达90％的纯度的成熟阶段感染的红细胞，并可以用于户外及实验室分离物。但是，正如前面提到的，plasmagel浮选删除玫瑰花PRBC以及不成熟的阶段，可能会导致在这些样品具有高的玫瑰花结次数减少结块的频率。然而，由于缺乏玫瑰花PRBC浮选plasmagel后不会影响结块的测定，，因为玫瑰花结的PRBC和未感染的红细胞而结块是pRBCs结合介导的血小板的相互作用。配体参与了这两个特点是不同的，主要是补体受体对未感染的红细胞调解玫瑰花结的CR-1。 prewarm琥珀酰明胶溶液和血清/ Albumax II培养基至37℃的水浴中。 培养转移到一个干净无菌的15毫升管和沉淀细胞在室温下以370×g离心5分钟，通过离心分离。 小心吸上清液，以便不打扰颗粒和悬浮细胞在同等体积的琥珀酰明胶和蛋白培养基。 混合物转移到无菌的15毫升管，并允许放置在37℃培养箱中培养15-20分钟，或直到一个明确的划分可以看出，上下水位之间。 小心转移上层新鲜无菌的15毫升管，加10毫升的新鲜RPMI。 离心5分钟370 XG仔细弃上清。 薄血涂片检查评估寄生虫和发育阶段，在光学显微镜下如第4节所述。 注：成熟PRBC范围的感染的红细胞dependi的60-90％之间纳克文化的初始寄生虫。对于成熟的寄生虫的比例较高，使用文化的初始寄生虫≥10％。 5。丛生含量使用一个纽鲍尔haematocytometer的计数并调整PRBC浮选plasmagel后得到的悬浮液1×10 8 PRBC个/μl。 在一个新的1.5毫升管中，重新悬浮于5％的血细胞比容浓度为20μg/ ml的终浓度和PRP的总体积的10％，吖啶橙猪红细胞。 吖啶橙，而是可以被污染的寄生虫培养与使用前的5分钟25微克/毫升的溴化3,8 – 二氨基-5 – 乙基-6 – 苯基菲啶溴化。 例如，对于一个200微升反应混合物，加10微升成熟的PRBC 300×10 3 /微升PRP血小板从健康献血者或150×10 3从SM患者血小板/微升和170微升蛋白培养基，20微升。 注意：血小板：猪红细胞在最终反应的比率是20:1。这是很重要的，是允许的格言这个结块的样品的频率来确定。如果增加血小板减少对照，然后并非所有的聚集pRBCs可能有机会聚集。 以同样的方式准备控制;未受感染的红血细胞和PRP，PPP PRBC确定血小板的作用在pRBCs结块。 暂停转移到1.5-2.0毫升锥形螺丝帽小瓶。 将小瓶在温和搅拌下，在10-12 rpm的转速下，在室温下轧制。 检查丛形成由准备湿滑动的通过吸取10μlPRBC±血小板混合在玻片上，盖上玻璃条，并检查下荧光。 可以做到在15-20分钟的时间间隔采样，共120分钟。一丛被视为合共三个或更多的感染红细胞。