JoVE Journal > Immunology and Infection
Summary
Abstract
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
免疫与感染

بروتوكول بسيط لتجمع الصفائح الدموية بوساطة<em> المتصورة المنجلية</emتبدي الكريات الحمر> بالفيروس في أجواء فقيرة الموارد

Published: May 16, 2013
doi:
10.3791/4316
, , ,
1Malawi-Liverpool-Wellcome Trust Clinical Research Programme, 2Liverpool School of Tropical Medicine, 3Department of Microbiology, Division of Medical Parasitology,New York University School of Medicine

Summary

هذا الأسلوب يحقق في النمط الظاهري تكتل الصفائح الدموية بوساطة<em> المتصورة المنجلية</em> الكريات الحمراء المصابة (pRBC) في العزلات السريرية. يتم تنفيذ ذلك عن طريق عزل وشارك في احتضان البلازما الغنية الصفيحات وتعليق pRBC.

Abstract

P. falciparum causes the majority of severe malarial infections. The pathophysiological mechanisms underlying cerebral malaria (CM) are not fully understood and several hypotheses have been put forward, including mechanical obstruction of microvessels by P. falciparum-parasitized red blood cells (pRBC). Indeed, during the intra-erythrocytic stage of its life cycle, P. falciparum has the unique ability to modify the surface of the infected erythrocyte by exporting surface antigens with varying adhesive properties onto the RBC membrane. This allows the sequestration of pRBC in multiple tissues and organs by adhesion to endothelial cells lining the microvasculature of post-capillary venules 1. By doing so, the mature forms of the parasite avoid splenic clearance of the deformed infected erythrocytes 2 and restrict their environment to a more favorable low oxygen pressure 3. As a consequence of this sequestration, it is only immature asexual parasites and gametocytes that can be detected in peripheral blood.

Cytoadherence and sequestration of mature pRBC to the numerous host receptors expressed on microvascular beds occurs in severe and uncomplicated disease. However, several lines of evidence suggest that only specific adhesive phenotypes are likely to be associated with severe pathological outcomes of malaria. One example of such specific host-parasite interactions has been demonstrated in vitro, where the ability of intercellular adhesion molecule-1 to support binding of pRBC with particular adhesive properties has been linked to development of cerebral malaria 4,5. The placenta has also been recognized as a site of preferential pRBC accumulation in malaria-infected pregnant women, with chondrotin sulphate A expressed on syncytiotrophoblasts that line the placental intervillous space as the main receptor 6. Rosetting of pRBC to uninfected erythrocytes via the complement receptor 1 (CD35)7,8 has also been associated with severe disease 9.

One of the most recently described P. falciparum cytoadherence phenotypes is the ability of the pRBC to form platelet-mediated clumps in vitro. The formation of such pRBC clumps requires CD36, a glycoprotein expressed on the surface of platelets. Another human receptor, gC1qR/HABP1/p32, expressed on diverse cell types including endothelial cells and platelets, has also been shown to facilitate pRBC adhesion on platelets to form clumps 10. Whether clumping occurs in vivo remains unclear, but it may account for the significant accumulation of platelets described in brain microvasculature of Malawian children who died from CM 11. In addition, the ability of clinical isolate cultures to clump in vitro was directly linked to the severity of disease in Malawian 12 and Mozambican patients 13, (although not in Malian 14).

With several aspects of the pRBC clumping phenotype poorly characterized, current studies on this subject have not followed a standardized procedure. This is an important issue because of the known high variability inherent in the assay 15. Here, we present a method for in vitro platelet-mediated clumping of P. falciparum with hopes that it will provide a platform for a consistent method for other groups and raise awareness of the limitations in investigating this phenotype in future studies. Being based in Malawi, we provide a protocol specifically designed for a limited resource setting, with the advantage that freshly collected clinical isolates can be examined for phenotype without need for cryopreservation.

Protocol

1. جمع العينات الصفائح الدموية يمكن تفعيلها بسهولة من خلال درجة الحرارة، والإثارة أو التخزين، وبالتالي ينبغي التعامل معها بحذر. استخدام vacutainers لجمع الدم لإعداد الصفائح الدموية أمر لا مفر منه في معظم الحالات السريرية، ولكن ينبغي النظر بعناية كما الشفط يمكن أن يسبب نشاط الصفائح الدموية. ونظرا لبروتوكول السريرية المستخدمة في المستشفى أبحاثنا، يتم جمع عينات لدينا بعناية في vacutainers سيترات الصوديوم. ونحن لم تشهد أي مشاكل مع سابق لأوانه نشاط الصفائح الدموية في هذا أو لدينا 12 دراسة سابقة. نحن جمع الدم لإعداد الصفائح الدموية من الدم O + مجموعة الأفراد للحد من فصيلة الدم غير محدد تجميع مستضد. وأيضا لم تتخذ الجهات المانحة الدواء في 7-10 أيام السابقة كما هي معروفة بعض الأدوية للتأثير على وظائف الصفائح الدموية. 1.1 إعداد البلازما الغنية الصفيحات (الحزب الثورى) جمع ما يقرب من 5 ملمن الدم الكامل من مجموعة ساذجة الملاريا أو 2.5 مل من الدم من سم أو الملاريا الحادة (SM) من المرضى في vacutainer سترات الصوديوم (BD رقم المنتج 36276). أجهزة الطرد المركزي في الدم الكامل في 250 x ج لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. لا أجهزة الطرد المركزي في 4 درجات مئوية كما درجات الحرارة المنخفضة قد تتسبب في الصفائح الدموية لتجميع. نقل بعناية طاف غائم في بيئة نظيفة 15 مل أنبوب. الصفائح الدموية يتم تنشيطها بسهولة من خلال الاختلافات في درجة الحرارة والصدمات المادية وبالتالي ينبغي التعامل معها بحذر. تجنب اهتزاز أو أي حركات متشنج من الأنبوب. استخدام haematocytometer على نيوباور إلى الاعتماد وضبط نظام التعليق الصفائح الدموية ل> 300 × 10 3 الصفائح الدموية / ميكرولتر لالمتبرعين الأصحاء و<150 × 10 3 الصفائح الدموية / ميكرولتر من CM والمرضى SM باستخدام 1X العازلة الفوسفات (درجة الحموضة 7،2-7،4؛ PBS). تأكد من اختيار عامل تخفيف عالية لتخفيف عدد الصفائح الدموية وضمان دقتها. ملاحظة: الملاريا باتients يقل لديهم عدد الصفائح الدموية بالمقارنة مع الاشخاص الاصحاء 16،17،18. تم تعديل تركيزات بالتالي الصفائح الدموية لCM و أم وفقا لمتوسط ​​عدد الصفائح الدموية لمرضى داخل كل مجموعة التشخيص الملاريا. وP. المنجلية النمط الظاهري التثاقل هو شائع في العزلات CM ويعرض تقارب ملزمة قوية وبالتالي فإن انخفاض تركيزات الصفائح الدموية لا يؤثر على حجم أجمة أو تردد منذ تركيز الصفائح الدموية هي موحدة لجميع الحالات CM. 1.2 إعداد الصفائح الدموية للفقراء البلازما (PPP) للحصول على PPP، أجهزة الطرد المركزي لجزء من الحزب الثورى الحصول عليها أعلاه في 1،500 x ج لمدة 10 دقيقة. الغالبية من الصفائح الدموية هي مكعبات في الجزء السفلي من الأنبوب. ويمكن تخزين كل من الحزب الثورى وPPP عند 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى أسبوعين. ومن الناحية المثالية، واستخدام الصفائح الطازجة للمقايسة التثاقل. بعد 8-10 يوما أكثر من الصفائح الدموية من المحتمل أن تكون غير نشطة وربما المجمعة. 2. الفقراتالفنار الثقافة غسل مكعبات pRBC ثلاث مرات مع 5-10 مل المتوسط ​​1640 بواسطة الطرد المركزي في 370 x ج لمدة 5 دقائق. ملاحظة: في هذا البروتوكول جميع الثقافات بدأ من حوالي 1 مل حجم الخلية معبأة (PCV) وحافظت على 5٪ الهيماتوكريت. يمكن أن تبدأ الثقافات مع أي PCV من pRBC وتعديلها وفقا لذلك مع RBC غير المصاب وسائل الإعلام للوصول إلى الهيماتوكريت المرجوة. وضع pRBC في قارورة الثقافة والملحق مع معيار مستنبت الملاريا من المتوسط ​​1640 تستكمل مع 25 ملي HEPES، 5٪ Albumax II أو 10٪ مصل و 40 ميكروغرام / مل جنتاميسين لتحقيق الهيماتوكريت 5٪. تتخلل قوارير الثقافة مع خليط من النيتروجين 92.5٪، 2.5٪ من الأكسجين وثاني أكسيد الكربون 5٪ قبل أن ينتزع ويحتضنها. بدلا من ذلك، محكمة الغلق طريقة جرة شمعة من تراغر-جنسن يمكن استخدامها. لpRBC الحصول عليها مباشرة من المرضى، واحتضان قارورة ثقافتهم ل 24-36 ساعة في الحاضنة 37 درجة مئوية في 5٪ CO 2 للحصول على الطفيليات ناضجة. ملاحظة: Mمختبر OST وخطوط ثقافة تكييفها من السهل جدا للحفاظ على الثقافة في ظل الظروف القياسية. هناك تقنيات بسيطة هو موضح أدناه والتي يمكن استخدامها لمزامنة مراحل الطفيلي مختلفة للاحتفاظ معدل النمو. تعد اللطاخة الدموية رقيقة كما هو موضح أدناه وفحص نضوج الطفيلي تحت المجهر الخفيفة. 3. رقيقة الدم السينمائي إعداد الشرائح ضع حوالي 10-15 ميكرولتر من الدم على نهاية واحدة من شريحة زجاجية بلوري يستريح على سطح مستو. تلمس قطرة دم مع حافة الشريحة الثانية حتى ينتشر بالتساوي الدم عبر حافة الشريحة الثانية. في حين عقد الشريحة الثانية في درجة 45 زاوية، بسرعة ولكن بلطف، دون بذل الكثير من الضغط على الشريحة الأولى، مرر الدم عبر الشريحة الأولى لجعل طبقة رقيقة من الدم الذي ينتشر بالتساوي. الهواء الجاف. تراجع الشريحة في الميثانول لمدة 10 ثانية. الهواء الجاف. تراجع الشريحة في 2٪ بالغيمزا شارععين لمدة 10 دقيقة على الأقل. شطف على نطاق واسع حتى الماء يتدفق واضحة. الهواء الجاف. فحص الشريحة باستخدام 90-100X عدسة مستحلب الزيت على ضوء المجهر 4. تنقية وتزامن مراحل اللاجنسي تنقية P. ناضجة المنجلية pRBC هو خطوة لازمة لفحص التكتل. في الواقع، فقط طفيليات ناضجة قادرة على الالتصاق بمستقبلات الصفيحات كما هو الحال في هذه المرحلة دورة الحياة أن بروابط ذات الصلة يتم التعبير عن وتبرز من سطح الكريات الحمراء المصابة. هناك عدة طرق لتنقية ومزامنة مراحل اللاجنسي من P. المنجلية: مراحل اللاجنسي في وقت متأخر يمكن أثرى Percoll التدرج 19؛ الخلية المغناطيسي فرز 20 أو باستخدام الجيلاتين الترسيب بروتوكول الموصوفة هنا 21. السوربيتول تزامن يختار لمراحل حلقة 22، وبعد ذلك يتم استزراع الحلقات للموارد البشرية 24-26 للحصول على المراحل الناضجة (مع لا غيرالعيدين لأداء التعويم الجيلاتين). 4.1 هلامة بلازمية التعويم يستخدم هلامة بلازمية التعويم حل الجيلاتين مثل لتحديد لانخفاض الوزن knobbed الكريات الحمراء أن تظل في حل حين أن أشكال حلقة كثيفة وريدات تنزل الى القاع. هذا الأسلوب يعطي نقاء تصل إلى 90٪ من الكريات الحمراء الناضجة مرحلة المصابة، ويمكن أن تستخدم في كل مجال ويعزل المختبر. ومع ذلك، وكما ذكر سابقا، هلامة بلازمية التعويم يزيل rosetting pRBC وكذلك مراحل غير ناضجة الذي يمكن أن يؤدي إلى انخفاض وتيرة التثاقل في تلك العينات مع تردد rosetting عالية. ومع ذلك، فإن غياب pRBC rosetting بعد هلامة بلازمية التعويم لن يؤثر على فحص التثاقل بسبب rosetting هو تفاعل الكريات الحمراء pRBC وغير المصابة في حين التثاقل هو pRBCs بوساطة ملزمة من قبل الصفائح الدموية. يجند المشاركة في هذه الصفات اثنين مختلفة؛ مع مستقبلات تكمل أساسا CR-1 على كريات الدم الحمراء غير مصاب التوسط rosetting. حل Gelofusine Prewarm والمصل / Albumax خالية المتوسطة II إلى 37 درجة مئوية في حمام مائي. نقل الثقافة إلى بيئة نظيفة معقمة 15 مل أنبوب وخلايا بيليه بواسطة الطرد المركزي عند درجة حرارة الغرفة في 370 x ج لمدة 5 دقائق. نضح بعناية طاف حتى لا تعكر صفو بيليه والخلايا resuspend في حجم مساو من Gelofusine والمتوسطة الخالية من البروتين. نقل الخليط إلى أنبوب معقم 15 مل والسماح للوقوف لمدة 15-20 دقيقة في الحاضنة 37 درجة مئوية أو حتى يمكن رؤية ترسيم الحدود واضحة بين مستوى العلوي والسفلي. نقل بعناية الطبقة العليا إلى أنبوب معقم 15 مل الطازجة وإضافة 10 مل من RPMI الطازجة. الطرد المركزي في 370 x ج لمدة 5 دقائق وتجاهل طاف بعناية. تقييم مرحلة الطفيليات في الدم والإنمائية التي اللطاخة الدموية رقيقة وفحص تحت المجهر ضوء كما هو موضح في القسم 4. ملاحظة: النطاق pRBC الناضجة بين 60-90٪ من الكريات الحمراء المصابة dependiنانوغرام على الطفيل الأولي للثقافة. لنسبة عالية من الطفيليات ناضجة، واستخدام الثقافات مع الطفيليات في الدم الأولي من ≥ 10٪. 5. التثاقل الفحص استخدام haematocytometer على نيوباور إلى الاعتماد وضبط نظام التعليق pRBC تم الحصول عليها بعد التعويم هلامة بلازمية إلى 1 × 10 8 pRBC / ميكرولتر. في أنبوب 1.5 مل الطازجة، resuspend pRBC في الهيماتوكريت 5٪، أكريدين البرتقال في 20 ميكروغرام / مل تركيز النهائي والحزب الثورى بنسبة 10٪ من حجم التداول الكلي. بدلا من أكريدين البرتقال، يمكن ملطخة الثقافات الطفيلي مع 25 ميكروغرام / مل بروميد إيثيديوم لمدة 5 دقائق قبل الاستخدام. على سبيل المثال للحصول على 200 ميكرولتر مزيج التفاعل، إضافة 10 ميكرولتر pRBC ناضجة، 20 ميكرولتر من 300 × 10 3 الصفائح الدموية / ميكرولتر لPRP من المتبرعين الأصحاء أو 150 × 10 3 الصفائح الدموية / ميكرولتر من المرضى SM و 170 ميكرولتر من متوسطة خالية من البروتين. ملاحظة: نسبة الصفائح الدموية: pRBC في ردود الفعل النهائي هو 20:01. وهذا أمر مهم كما هو يسمح مكسيمأم تردد التثاقل من عينة يحدد لاحقا. إذا تم إضافة عدد أقل من الصفائح الدموية في الضوابط ثم قد لا كل pRBCs التثاقل تتاح لهم الفرصة لأجمة. في نفس الطريق إعداد الضوابط التالية؛ المعافين خلايا الدم الحمراء والحزب الثورى، وpRBC مع PPP للتأكد من دور الصفائح الدموية في تكتل pRBCs. نقل تعليق إلى 1.5-2.0 مل مخروطي قارورة المسمار الحد الأقصى. ضع القارورة في إطار التحريض لطيف من قبل المتداول في 10-12 دورة في الدقيقة في درجة حرارة الغرفة. تحقق لتشكيل أجمة من قبل شريحة الرطب من قبل pipetting 10 ميكرولتر من pRBC أعد ± مزيج الصفائح الدموية على شريحة زجاجية، وتغطي مع كوب الانزلاق وفحص تحت مضان. ويمكن أن يتم أخذ العينات على فترات 15-20 دقيقة ليصبح المجموع 120 دقيقة. ويعتبر أجمة بوصفه الكلي من ثلاثة أو أكثر من كرات الدم الحمراء المصابة.

Representative Results

مثال لفحص الصفائح الدموية تتجمع بوساطة استخدام ما يقرب من 70٪ من مراحل النضج P. ويرد المنجلية بعد التخصيب بحلول هلامة بلازمية التعويم في الشكل 2. A أجمة هو مجموع من ثلاثة أو أكثر من كرات الدم الحمراء المصابة. يمكن تلطيخ مع أكريدين البرتقال أو إيثيديوم بروميد يمكن تصور بواسطة المجهر مضان. أكريدين البرتقال يشبه طيفيا إلى فلوريسئين، مع أقصى قدر من الإثارة في 502 نانومتر وأقصى الانبعاثات في 525 نانومتر (الأخضر)، بينما إيثيديوم بروميد لديه الحد الأقصى الإثارة في 493 نانومتر وأقصى الانبعاثات في 620 نانومتر (على غرار الأصباغ رودامين والأحمر ). ورصدت كتل بسهولة تحت المجهر وتحت ضوء طبيعي كما تظهر المجاميع الخلية وتحت مضان على شكل بقع من اللون الأخضر أو الأحمر عندما ملطخة أكريدين البرتقال أو الأصباغ بروميد إيثيديوم، على التوالي، كما هو مبين في الشكل 2 (30 دقيقة نقطة زمنية باستخدام أكريدين البرتقال ). أكبر كتل، أكبر التجميعية الخلية يظهر للأمم المتحدةدير الضوء الطبيعي وكلما كانت بقع من تحت أخضر أو ​​أحمر يتألق لالأصباغ منها. منذ الأصباغ الهدف DNA وبالتالي نوى وصمة عار، والصفائح الدموية RBC غير مصاب لم يتم الكشف عنها تحت المجهر الفلورسنت بسبب افتقارها للنوى. تشكيل عشوائية من كتل صغيرة من pRBC 4.7 ± 1.6 pRBCs / أجمة تحدث بعد 30 دقيقة. حجم أجمة يزيد بشكل كبير إلى ما متوسطه 15> pRBC / كتل بعد حضانة لمدة 120 دقيقة مع بعض كتل تحتوي على العديد من pRBC / أجمة التي لا يمكن عدها بصريا. يتم احتساب وتيرة النمط الظاهري التثاقل حيث وصل عدد الخلايا المصابة الموجودة في كتل / 1،000 الخلايا المصابة، وعدها في المقايسات مكررة. الشكل 1. تدفق العمل لتراكمها التجربة. صفائح الدم Rالتراث الثقافي غير المادي والفقراء البلازما (A) وP. ثقافة كرات الدم الحمراء المنجلية المصابة (ب) تعد وثم مجتمعة لفحص التكتل (C). الشكل 2. تراكمها من الكريات الحمراء المصابة بواسطة P. المنجلية مختبر عزل. كتل التي شكلتها HB3 في الوقت 0، 30 و 120 دقيقة في البلازما الغنية الصفيحات (A) والفقراء تشكيل أجمة في الصفائح الدموية الفقراء البلازما (B). القيود مقايسة هناك قيود التي تؤثر على وجه التحديد وظيفة الصفيحات أو نتيجة النفوذ ومعظم هذه قد تم تسليط الضوء من قبل عرمان ورو 15. هنا نذكر بعض المشاكل المحتملة التي قد تواجهها في احمراحل NT للمقايسة: يمكن التكيف العزلات السريرية لفي الثقافة المختبر يشكل تحديا وأحيانا مطلوبة فترات أطول الثقافة من أجل تحقيق الطفيليات في الدم عالية بما فيه الكفاية للسماح تشكيل كتل. مع ارتفاع معدلات التباين الأنتيجين في P. المنجلية، قد النمط الظاهري لاصق للطفيل مكيفة الثقافة لا تعكس الأصلي السكان طفيلي يصيب بعد الأزمنة المتطاولة في الثقافة. من أجل تجنب تراص غير محددة قد يعزى إلى مجموعة مولدات المضادات في الدم، وينبغي أن تكون مطابقة الصفائح الدموية الجهات المانحة للمستضد فصيلة الدم مع العزلات السريرية المستخدمة في نفس الفحص، أو مجموعة المستضد للمتبرعين بالدم عالمية O-استخدامها. ومع ذلك، فإن الأفراد مع فصيلة الدم O-نادرة في المواقع الأفريقية مثل ملاوي وبالتالي الصفائح المستخدمة عادة يتم الحصول عليها من الدم O + مجموعة المانحين، ويجب أن تكون مطابقة لفصيلة الدم. عد كتل على إعداد الشرائح الرطب مرهقة وصعبة لالتقاط الصور كما جells هي في حركة مستمرة. عادة، pRBC تتراكم على حواف الغطاء زلة أو أنها تميل إلى العصا معا تشكيل كتل "كاذبة" والتي يمكن الخلط بسهولة مع كتل الحقيقي. من أجل الحد من حركة الخلية، تسمح للخلايا أن الرواسب لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة قبل التحليل. مقايسة تكتل حساس في الوقت، وبالتالي يسمح فقط عينة واحدة ليتم تحليلها للشخص في وقت واحد للتأكد من دقتها الأمثل. يمكن أخذ العينات من النقاط الزمنية لمدة عينات مختلفة تتداخل بسهولة، مما أدى متطابقة نقاط أخذ العينات الوقت بين العينات إذا مناولة العينات أكثر من واحد في نفس الوقت. في مثل هذه الظروف، يمكن أن البرمجيات الكمية المتطورة حساب أحجام أجمة أو بدلا من الأجسام المضادة خلية محددة يمكن استخدامها لتحليل تكوين كتل. في حين أن هذه التقنيات يمكن أن تحسن كثيرا من أهمية البيانات، في البيئات فقيرة الموارد حيث من المرجح أن يتم استخدام هذا الاختبار، مثل هذه التقنيات والمعدات ليست متاحة بسهولة.

Discussion

وصفناها فحص تجمع الصفائح الدموية بوساطة تستخدم لدراسة pRBC في العزلات السريرية مباشرة في الميدان. تكتل الصفائح الدموية بوساطة، والسلوك المميز في P. وقد تم تحديد العزلات السريرية المنجلية، باعتباره النمط الظاهري لاصق متميزة، وكثرة في العزلات CD36 ملزم 12،23-24. وقد استخدمنا هذا الاختبار لتحديد ثلاث نقاط رئيسية هي: 1) قوية في المختبر النمط الظاهري التثاقل من P. المنجلية المعزولة من الأطفال مالاوى مقترن شدة المرض والتشخيص 2) رواية مستقبلات mediaties ف selectin التثاقل على الصفائح الدموية معا مع CD36، 3) درجة الصفيحات موجودة في المرضى الذين يعانون من CM كافية للحد من تشكيل مزيد من كتل pRBC في المختبر 12. ويتجلى إشراك الصفائح الدموية في تشكيل أجمة من خلال فحص إعداد الرطب الشريحة كما هو موضح في القسم 6. الصفائح الدموية يمكن عزلها عن الحزب الثورى بواسطة الطرد المركزي بسرعات عاليةمن أجل تقليل مجموعة تفاعلات الأنتيجين الدم، ومع ذلك، كنا الحزب الثورى كله من أجل تقليل سابق لأوانه تنشيط صفائح الدم من الإفراط في التعامل مع وعن الطرد المركزي عالية السرعة. ويمكن قياس نشاط الصفائح الدموية من خلال اختبار تراكم الصفائح الدموية باستخدام ضعيفة منبهات الصفائح الدموية، ادرينالين أو ثنائي فسفات الأدينوزين (ADP) 25 كما هو موضح في 26.

هناك جوانب عديدة للمقايسة التي سبق لها أن تتميز على نحو رديء، واحد منهم على أهمية اختيار مصادر الحزب الثورى وتأثير الجماعات مستضد الدم على نتائج الفحص. نحن على استعداد الحزب الثورى من الأفراد الذين كانوا فصيلة الدم O + وأنها لم تتخذ أي دواء في الأيام الأخيرة قبل 7-10 ويوجه الدم وبعض الأدوية يمكن أن تؤثر على سلوك الصفائح الدموية.

العوامل الأخرى التي قد تؤثر على نجاح تكتل تشمل pRBC الهيماتوكريت، ومستويات الطفيليات في الدم وطول مدة الفحص التثاقل. باستخدام الهيماتوكريت عالية وشارك الصفائح الدمويةالاتحاد الوطني للعمال انه سيكون من الصعب معرفة ما إذا كانت الكتلة هي حقا أجمة أو ما إذا كان عدد كبير جدا من الخلايا مجرد الجلوس معا لأنها مكتظة معبأة 15. التثاقل أيضا يزيد عموما مع أوقات الحضانة لفترة أطول. هذه هي جميع المبادئ التوجيهية المفيدة التي ينبغي أخذها في الاعتبار عند تصميم الدراسات التثاقل.

نجد أن عينات من مجموعات سريرية مختلفة يمكن تحليلها في المتوازي باستخدام PRP من نفس المانحة إذا كان من الممكن القيام بذلك، ولكن في إعدادات الموارد محدودة مثل المواقع الميدانية هو تجمع نقل تقتصر عادة. ولذلك فمن الصعب أن يكون لها + O واحد المانحة لتوحيد المقايسات. لذلك حددنا عدة O + الجهات المانحة لضمان التوافق فصيلة الدم كلما كان ذلك ممكنا. باستخدام جهات مانحة متعددة هي أيضا مفيدة في حالات العينات أحجام كبيرة بحيث عبء التبرع بالدم لا تقع على فرد واحد فقط.

نقاط أخذ العينات في 15-20 دقيقة هي أكثر جدوى بكثير إذا PE واحدrson يتم إجراء فحوصات، والسماح لاستعدادات الرطب للانزلاق، وأداء حركية فحص دون تداخل أوقات لأخذ العينات. معظم البيانات المجهرية هو مرئي وموضوعية إلى حد ما، وبالتالي، فمن المهم أن يتم التحقق العد الخلية عن طريق أكثر من شخص واحد. في هذه الحالة، يمكن التعامل مع عينة واحدة في وقت واحد يسمح تحليل كامل من 3-4 عينات يوميا اعتمادا على الكفاءة الشخصية.

تكتل الصفائح الدموية بوساطة يمكن القيام بها باستخدام كل من العزلات السريرية والمختبرية. لخطوط المختبر، فمن المستحسن أن يتم استخدام CD36 الطفيليات ملزمة لتحقيق أقصى قدر من الترددات التثاقل. يمكن أن يقترن مقايسة مع المقايسات تراص أخرى مثل rosetting أو المستخدمة في التثاقل المقايسات تثبيط من شأنها أن تمكن الدراسة من المستقبلات على الصفائح الدموية التي قد توسط ملزم pRBC، وهو جانب غير مفهومة وفحصها من هذا النمط الظاهري.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

وقدم هذا العمل ممكن عن طريق تمويل من ويلكوم ترست. JM (080964) والمجلس الأعلى للمرأة (080948) وبدعم من ويلكوم ترست والزمالات DT من قبل مالاوي-ليفربول-يلكوم ترست دراسية ل.

Materials

Name of the reagent Company Catalog number Comments
RPMI 1640 Invitrogen 21870-092
Acridine orange Invitrogen A3568 10 mg/ml
Gelofusine B Braun Gelofusine
1 M HEPES Invitrogen 15630
Gentamycin Invitrogen 15750045 50 mg/ml
Albumax GIBCO 1102-037
Sodium citrate vacutainer BD 362760 4 ml capacity
Inverted Microscope Leica MD16000 B
Fluorescent microscope Leica EL6000 Contains blue and green light fluorescent filters for acridine orange and ethidium bromide
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Miller, L. H., Baruch, D. I., Marsh, K., Doumbo, O. K. The pathogenic basis of malaria. Nature. 415, 673-679 (2002).
  2. Saul, A. The role of variant surface antigens on malaria-infected red blood cells. Parasitol. Today. 15, 455-457 (1999).
  3. Miller, L. H., Good, M. F., Milon, G. Malaria pathogenesis. Science. 264, 1878-1883 (1994).
  4. Newbold, C., et al. Receptor-specific adhesion and clinical disease in Plasmodium falciparum. Am. J. Trop. Med. Hyg. 57, 389-398 (1997).
  5. Turner, G. D. An immunohistochemical study of the pathology of fatal malaria. Evidence for widespread endothelial activation and a potential role for intercellular adhesion molecule-1 in cerebral sequestration. Am. J. Pathol. 145, 1057-1069 (1994).
  6. Fried, M., Duffy, P. E. Adherence of Plasmodium falciparum to chondroitin sulfate A in the human placenta. Science. 272, 1502-1504 (1996).
  7. Rowe, J. A., Moulds, J. M., Newbold, C. I., Miller, L. H. P. falciparum rosetting mediated by a parasite-variant erythrocyte membrane protein and complement-receptor 1. Nature. 388, 292-295 (1997).
  8. Udomsangpetch, R., et al. Plasmodium falciparum -infected erythrocytes form spontaneous erythrocyte rosettes. J. Exp. Med. 169, 1835-1840 (1989).
  9. Rowe, J. A., Kyes, S. A., Rogerson, S. J., Babiker, H. A., Raza, A. Identification of a conserved Plasmodium falciparum var gene implicated in malaria in pregnancy. J. Infect. Dis. 185, 1207-1211 (2002).
  10. Biswas, A. K. Plasmodium falciparum uses gC1qR/HABP1/p32 as a receptor to bind to vascular endothelium and for platelet-mediated clumping. PLoS Pathog. 3, 1271-1280 (2007).
  11. Grau, G. E. Platelet accumulation in brain microvessels in fatal pediatric cerebral malaria. J. Infect. Dis. 187, 461-466 (2003).
  12. Wassmer, S. C. Platelet-induced clumping of Plasmodium falciparum-infected erythrocytes from Malawian patients with cerebral malaria-possible modulation in vivo by thrombocytopenia. J. Infect. Dis. 197, 72-78 (2008).
  13. Mayor, A., et al. Association of severe malaria outcomes with platelet-mediated clumping and adhesion to a novel host receptor. PLoS One. 6, e19422 (2011).
  14. Arman, M., et al. Platelet-Mediated Clumping of Plasmodium falciparum Infected Erythrocytes Is Associated with High Parasitemia but Not Severe Clinical Manifestations of Malaria in African Children. Am. J. Trop. Med. Hyg. 77, 943-946 (2007).
  15. Arman, M., Rowe, J. A. Experimental conditions affect the outcome of Plasmodium falciparum platelet-mediated clumping assays. Malar. J. 7, 243 (2008).
  16. Beale, P. J., Cormack, J. D., Oldrey, T. B. Thrombocytopenia in malaria with immunoglobulin (IgM) changes. Br. Med. J. 1, 345-349 (1972).
  17. Jy, W., et al. Platelet aggregates as markers of platelet activation: characterization of flow cytometric method suitable for clinical applications. Am. J. Hematol. 57, 33-42 (1998).
  18. Wilson, J. J., Neame, P. B., Kelton, J. G. Infection-induced thrombocytopenia. Semin. Thromb. Hemost. 8, 217-233 (1982).
  19. Wahlgren, M., Berzins, K., Perlmann, P., Persson, M. Characterization of the humoral immune response in Plasmodium falciparum malaria. II. IgG subclass levels of anti-P. falciparum antibodies in different sera. Clin. Exp. Immunol. 54, 135-142 (1983).
  20. Uhlemann, A. C., Staalsoe, T., Klinkert, M. Q., Hviid, L. Analysis of Plasmodium falciparum-infected red blood cells. MACS. 4, 7-8 (2000).
  21. Goodyer, I. D., Johnson, J., Eisenthal, R., Hayes, D. J. Purification of mature-stage Plasmodium falciparum by gelatine flotation. Ann. Trop. Med. Parasitol. 88, 209-211 (1994).
  22. Lambros, C., Vanderberg, J. P. Synchronization of Plasmodium falciparum erythrocytic stages in culture. J. Parasitol. 65, 418-420 (1979).
  23. Chotivanich, K., et al. Platelet-induced autoagglutination of Plasmodium falciparum-infected red blood cells and disease severity in Thailand. J. Infect. Dis. 189, 1052-1055 (2004).
  24. Pain, A., et al. Platelet-mediated clumping of Plasmodium falciparum-infected erythrocytes is a common adhesive phenotype and is associated with severe malaria. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 1805-1810 (2001).
  25. Wallace, M. A., Agarwal, K. C., Garcia-Sainz, J. A., Fain, J. N. Alpha-adrenergic stimulation of phosphatidylinositol synthesis in human platelets as an alpha-2 effect secondary to platelet aggregation. J. Cell Biochem. 18, 213-220 (1982).
  26. Zhou, L., Schmaier, A. H. Platelet aggregation testing in platelet-rich plasma: description of procedures with the aim to develop standards in the field. Am. J. Clin. Pathol. 123, 172-183 (2005).

Tags

Platelet-mediated ClumpingPlasmodium Falciparum-infected ErythrocytesResource Poor SettingCerebral MalariaMicrovessels ObstructionP. Falciparum-parasitized Red Blood CellsSequestrationEndothelial CellsPost-capillary VenulesSplenic ClearanceLow Oxygen PressureCytoadherenceHost ReceptorsSevere Pathological Outcomes

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Tembo, D. L., Montgomery, J., Craig, A. G., Wassmer, S. C. A Simple Protocol for Platelet-mediated Clumping of Plasmodium falciparum-infected Erythrocytes in a Resource Poor Setting. J. Vis. Exp. (75), e4316, doi:10.3791/4316 (2013).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image