Summary

Bir Tam Kan fenotipleme Testi Kullanarak Çok Merkezli Klinik Araştırmalar için Binbaşı Periferik Kan Lökosit Populasyonlarının Numaralama

Published: September 16, 2012
doi:

Summary

Bu raporda, biz büyük doğal ve adaptif lökosit popülasyonlarının numaralandırmak için taze tam kan üzerinde gerçekleştirilen bir feno testinin boyama ve analiz adımları göstermektedir. Biz çok merkezli klinik çalışma kapsamında bu işlemler gerçekleştirmek için konuları vurgulamaktadır.

Abstract

Periferik kan lökositleri Kriyoprezervasyon yaygın klinik çalışmalarda bağışıklık yanıtı değerlendirme için hücreleri korumak için kullanılan ve immünolojik değerlendirme kolaylığı ve standardizasyon için birçok avantaj sunmaktadır, ancak bu sürecin olumsuz etkileri, granülosit gibi bazı hücre alt, B hücreleri üzerinde gözlenmiştir edilir , 1-3 ve dendritik hücreler. Taze lökositleri assaying hücrelerinin in vivo durumda daha doğru bir görüntü verir, ancak sık sık büyük klinik çalışmalarda bağlamında gerçekleştirmek zordur. Taze hücresi tayinlerinde zaman alıcı varsa, bunların uygulama nedeniyle laboratuvar personelinin gerekli çalışma saatleri için pratik olabilir, gönüllü taahhütler ve zamanlamalar bağlıdır ve. Buna ek olarak, çalışmalar birden fazla merkezde yürütülen zaman, testleri gerçekleştirmek için gerekli kaynakları ve eğitim laboratuvarları klinik siteleri için yeterli yakınında yer olmayabilir. Bu sorunları çözmek için, var develBöyle bir gibi testlere göre daha güçlü bir hücre tipinde belirli bir bilgi elde edilmesinde, fenotip için ve periferik kan içinde büyük lökosit popülasyonları numaralandırmasına; Trucount tüpler (San Jose, CA Becton Dickinson) ile birlikte kullanılabilecek bir 11 renkli antikor boyama paneli intravazasyonunda tam kan sayımı (CBC) veya sadece birkaç hücre tipleri için leke Trucount tüpler için tasarlanmış piyasada bulunan paneller ile ölçülür. Boyama işlemi basittir, taze tam kan sadece 100 ul gerektirir ve uygulanabilir standart kan işleme laboratuarları gerçekleştirmek için yapım, yaklaşık 45 dakika sürer. Bu BD Trucount tüp teknik föy (uyarlanmıştır sürüm 8/2010 ). Boyama antikor kokteyli merkezi bir tahlil laboratuvarından toplu olarak önceden hazırlanan ve site işleme laboratuarları sevk edilebilir. Vitray tüpler sabit olabilirve renkli akım sitometri analizi için merkezi tahlil laboratuvarından gönderilmek için dondurulmuş. Bu boyama panelinden üretilen veri müdahale ile ilgili olarak zaman içinde lökosit konsantrasyonlarda değişiklikleri izlemek için ve kolay bir şekilde daha fazla ilgi belirli hücre tipleri aktivasyonu durumları değerlendirmek için geliştirilmiş olabilir kullanılabilir. Bu yazıda, taze tam kan ve çok merkezli klinik araştırma merkezi bir destek tahlil laboratuvarında bu lekeli numunelerin analiz adımları boyama gerçekleştirmek için kan işleme laboratuvar teknisyenleri tarafından kullanılan yordam göstermek. Video ayrıntılar bu HIV aşısı Denemeler Ağı (HVTN) içinde bir klinik deneme kan alımından bağlamında yapılır gibi işlem.

Protocol

Not: ışıktan fluorofor konjuge antikorlar korumak için, ışığı bir biyo-güvenlik kabini tüm adımları gerçekleştirin. 1. Antikor Boyama Paneli Hazırlama Antikor boyama pano Tablo 1 'de bulunabilir. Antikor konsantrasyonu bütün kan ile titrasyon ile belirlenen ve aynı akış sitometrisi ekipman ve lekeli fenotipleme numuneleri elde etmek için kullanılacak olan prosedürler kullanılarak verilmelidir. Uygun boyama titreleri …

Discussion

Bu yazıda, flow sitometri ile taze tam kan lökosit popülasyonlarının numaralandırma için bir boncuk-tabanlı bir yöntem sunmak ve merkezi numune analizi ile çok merkezli bir klinik çalışmada kullanılması için gerekli parametreleri kapsamaktadır. Bu yöntem üzerine kurulmuş ve BD Trucount protokolü optimize eder ve çok merkezli klinik ortamda güvenilir kullanım sağlar. Boyama testi basit ve uygulanabilir kan işleme laboratuar teknisyenleri bunu gerçekleştirmek için ve analiz için merkezi bir t…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Bu yöntem, el yazması ve video gelişiminde onların yardım için Jessica Jones, Erica Clark, Constance Ducar, Donna Smith, Roy Lewis, Lily Apedaile, Joanne Wiesner, Devin Adams, Corey McBain ve Stephen Voght ederim.

Bu çalışma Bill ve Melinda Gates Vakfı CAVD hibe 38645 (MJM) ve Sağlık hibe Ulusal Sağlık Enstitüleri UM1 AI068618 ve U01 AI069481 (MJM) tarafından desteklenmiştir. EA-N. NIH Grant T32 AI007140 tarafından desteklenmektedir. Biz onların cömert donanım bağışı için James B. Pendleton Charitable Trust ederim.

Materials

Reagent Name Company Catalogue number
Trucount Absolute Counting Tubes BD Biosciences 340334
10X FACS Lysing Solution BD Biosciences 349202
Category B & Exempt Shipping System, Insulated Saf-T-Pak STP-320
CD45 AmCyan monoclonal antibody BD Biosciences 339192
CD3 FITC monoclonal antibody BD Biosciences 349201
CD8 PerCp-Cy 5.5 monoclonal antibody BD Biosciences 341051
CD4 Alexa Fluor 700 monoclonal antibody BD Biosciences 557922
HLA-DR ECD monoclonal antibody Beckman Coulter IM3636
CD14 v450 monoclonal antibody BD Biosciences 560349
CD19 PE monoclonal antibody BD Biosciences 555413
CD16 APC-H7 monoclonal antibody BD Biosciences 560195
CD56 PE-Cy7 monoclonal antibody BD Biosciences 335791
CD11c APC monoclonal antibody BD Biosciences 559877
CD123 PE-Cy5 monoclonal antibody BD Biosciences 551065

References

  1. Taylor, M. J., London, N. J., Thirdborough, S. M., Lake, S. P., James, R. F. The cryobiology of rat and human dendritic cells: preservation and destruction of membrane integrity by freezing. Cryobiology. 27, 269-278 (1990).
  2. Reimann, K. A., Chernoff, M., Wilkening, C. L., Nickerson, C. E., Landay, A. L. Preservation of lymphocyte immunophenotype and proliferative responses in cryopreserved peripheral blood mononuclear cells from human immunodeficiency virus type 1-infected donors: implications for multicenter clinical trials. The ACTG Immunology Advanced Technology Laboratories. Clin Diagn Lab Immunol. 7, 352-359 (2000).
  3. Boonlayangoor, P., Telischi, M., Boonlayangoor, S., Sinclair, T. F., Millhouse, E. W. Cryopreservation of human granulocytes: study of granulocyte function and ultrastructure. Blood. 56, 237-245 (1980).
  4. Perfetto, S. P., Ambrozak, D., Nguyen, R., Chattopadhyay, P., Roederer, M. Quality assurance for polychromatic flow cytometry. Nat Protoc. 1, 1522-1530 (2006).
  5. Brando, B., Barnett, D., Janossy, G., Mandy, F., Autran, B., Rothe, G., Scarpati, B., D’Avanzo, G., D’Hautcourt, J. L., Lenkei, R., Schmitz, G., Kunkl, A., Chianese, R., Papa, S., Gratama, J. W. Cytofluorometric methods for assessing absolute numbers of cell subsets in blood. European Working Group on Clinical Cell Analysis. Cytometry. 42, 327-346 (2000).
  6. Bull, M., Lee, D., Stucky, J., Chiu, Y. L., Rubin, A., Horton, H., McElrath, M. J. Defining blood processing parameters for optimal detection of cryopreserved antigen-specific responses for HIV vaccine trials. J. Immunol Methods. 322, 57-69 (2007).
  7. Kantor, A. B., Roederer, M., Herzenberg, L., Blackwell, C., Weir, D. . The handbook of Experimental Immunology. 43, 1-49 (1996).
  8. Hulspas, R. Flow cytometry and the stability of phycoerythrin-tandem dye conjugates. Cytometry A. 75, 966-972 (2009).
  9. Le Roy, C., Varin-Blank, N., Ajchenbaum-Cymbalista, F., Letestu, R. Flow cytometry APC-tandem dyes are degraded through a cell-dependent mechanism. Cytometry A. 75, 882-890 (2009).
  10. Mandy, F., Brando, B. Enumeration of absolute cell counts using immunophenotypic techniques. Curr. Protoc. Cytom. Chapter 6, Unit 6 (2001).
  11. Vuckovic, S. Monitoring dendritic cells in clinical practice using a new whole blood single-platform TruCOUNT assay. J. Immunol Methods. 284, 73-87 (2004).
  12. Lichtner, M. Circulating dendritic cells and interferon-alpha production in patients with tuberculosis: correlation with clinical outcome and treatment response. Clin. Exp. Immunol. 143, 329-337 (2006).
  13. Hosmalin, A., Lichtner, M., Louis, S. Clinical analysis of dendritic cell subsets: the dendritogram. Methods Mol. Biol. 415, 273-290 (2008).

Play Video

Cite This Article
Hensley, T. R., Easter, A. B., Gerdts, S. E., De Rosa, S. C., Heit, A., McElrath, M. J., Andersen-Nissen, E. Enumeration of Major Peripheral Blood Leukocyte Populations for Multicenter Clinical Trials Using a Whole Blood Phenotyping Assay. J. Vis. Exp. (67), e4302, doi:10.3791/4302 (2012).

View Video