Summary

La enumeración de las principales poblaciones de leucocitos de sangre periférica en ensayos clínicos multicéntricos utilizando un ensayo de sangre entera Fenotipado

Published: September 16, 2012
doi:

Summary

En este informe, demuestran los pasos de tinción y análisis de un ensayo de fenotipo realiza en la sangre entera fresca para enumerar las principales poblaciones de leucocitos innatos y adaptativos. Hacemos hincapié en las consideraciones para llevar a cabo estos procedimientos en el contexto de un ensayo clínico multicéntrico.

Abstract

Crioconservación de leucocitos de sangre periférica se utiliza ampliamente para conservar las células para las evaluaciones de la respuesta inmune en los ensayos clínicos y ofrece muchas ventajas para la facilidad y la normalización de las evaluaciones inmunológicas, pero los efectos perjudiciales de este proceso se han observado en algunos subconjuntos de células, tales como los granulocitos, células B , y las células dendríticas 1-3. Ensayo de leucocitos frescas da una imagen más precisa del estado in vivo de las células, pero a menudo es difícil de realizar en el contexto de ensayos clínicos grandes. Los ensayos de células frescas dependen de compromisos voluntarios y los plazos, y si consume tiempo, su aplicación puede ser poco práctico debido a las horas de trabajo necesarias del personal de laboratorio. Además, cuando los ensayos se llevan a cabo en varios centros, laboratorios con los recursos y la capacitación necesarios para llevar a cabo los ensayos no pueden estar situados en la proximidad suficiente a los sitios clínicos. Para abordar estas cuestiones, tenemos que desarrorrollado un panel de anticuerpos 11-tinción de color que se puede utilizar con tubos de Trucount (Becton Dickinson, San Jose, CA) a fenotipo y enumerar las principales poblaciones de leucocitos en la sangre periférica, con un rendimiento más robusto de células de tipo información específica de ensayos tales como un Recuento sanguíneo completo (CSC) o ensayos comercialmente disponibles con paneles diseñados para tubos Trucount que manchan por sólo unos pocos tipos de células. El procedimiento de tinción es simple, requiere sólo 100 l de sangre entera fresca, y tarda aproximadamente 45 minutos, por lo que es factible para el estándar de procesamiento de la sangre para llevar a cabo los laboratorios. Es una adaptación de la hoja BD Trucount tubo técnica de datos ( versión 8/2010 ). El cóctel de anticuerpos de tinción puede ser preparado de antemano a granel en un laboratorio central de ensayo y se envían a los laboratorios de transformación en el lugar. Tubos manchados puede ser fijadoy se congelan para su envío al laboratorio de ensayo central para el análisis multicolor citometría de flujo. Los datos generados a partir de este panel de tinción se puede utilizar para rastrear los cambios en las concentraciones de leucocitos en el tiempo en relación con la intervención y fácilmente podrían ser desarrolladas para evaluar los estados de activación de tipos de células específicas de interés. En este informe, demuestran el procedimiento utilizado por los técnicos de laboratorio de procesamiento de sangre para realizar la tinción de sangre entera fresca y los pasos para analizar estas muestras teñidas en un laboratorio de ensayo de soporte central un ensayo clínico multicéntrico. Los detalles del video del procedimiento, ya que se realiza en el contexto de un proyecto de ensayo clínico de la sangre en la Red de Ensayos de Vacunas contra el VIH (HVTN).

Protocol

Nota: Para proteger los anticuerpos conjugados con fluorocromo de la luz, realice todos los pasos en un gabinete de bioseguridad con la luz apagada. 1. Tinción de anticuerpos Panel Preparación El panel de tinción de anticuerpos se pueden encontrar en la Tabla 1. La concentración de anticuerpo debe ser definido por titulación con sangre entera y usando el equipo de citometría de flujo mismo y los procedimientos que se utilizarán para adquirir las mu…

Discussion

En este informe se presenta un método basado en perlas para enumerar las poblaciones de leucocitos en sangre entera fresca por citometría de flujo y cubrir los parámetros necesarios para su uso en un ensayo clínico multicéntrico con el análisis de muestras centralizado. Este método se basa en el protocolo y optimiza BD Trucount y permite su uso confiable en un entorno ensayo clínico multicéntrico. El ensayo de tinción es simple y toma aproximadamente 45 minutos para llevar a cabo, por lo que es factible para l…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Damos las gracias a Jessica Jones, Clark Erica, Ducar Constanza, Donna Smith, Lewis Roy, Apedaile Lily, Wiesner Joanne, Adams Devin, McBain Corey y Voght Stephen por su ayuda en el desarrollo de este método, manuscrito y video.

Este trabajo fue financiado por la Fundación Bill y Melinda Gates CAVD subvención 38.645 (MJM) y los Institutos Nacionales de Salud subvenciones UM1 AI068618 y AI069481 U01 (MJM). EA-N. es apoyado por el NIH subvención T32 AI007140. Damos las gracias a la James B. Pendleton Charitable Trust por su donación generosa equipo.

Materials

Reagent Name Company Catalogue number
Trucount Absolute Counting Tubes BD Biosciences 340334
10X FACS Lysing Solution BD Biosciences 349202
Category B & Exempt Shipping System, Insulated Saf-T-Pak STP-320
CD45 AmCyan monoclonal antibody BD Biosciences 339192
CD3 FITC monoclonal antibody BD Biosciences 349201
CD8 PerCp-Cy 5.5 monoclonal antibody BD Biosciences 341051
CD4 Alexa Fluor 700 monoclonal antibody BD Biosciences 557922
HLA-DR ECD monoclonal antibody Beckman Coulter IM3636
CD14 v450 monoclonal antibody BD Biosciences 560349
CD19 PE monoclonal antibody BD Biosciences 555413
CD16 APC-H7 monoclonal antibody BD Biosciences 560195
CD56 PE-Cy7 monoclonal antibody BD Biosciences 335791
CD11c APC monoclonal antibody BD Biosciences 559877
CD123 PE-Cy5 monoclonal antibody BD Biosciences 551065

References

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Cite This Article
Hensley, T. R., Easter, A. B., Gerdts, S. E., De Rosa, S. C., Heit, A., McElrath, M. J., Andersen-Nissen, E. Enumeration of Major Peripheral Blood Leukocyte Populations for Multicenter Clinical Trials Using a Whole Blood Phenotyping Assay. J. Vis. Exp. (67), e4302, doi:10.3791/4302 (2012).

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