ספירה של אוכלוסיות גדולות דם היקפיות יקוציט לניסויי multicenter קליניים באמצעות Assay phenotyping דם מלא
Summary
בדו"ח זה, אנו מדגימים את שלבי צביעה וניתוח של assay phenotyping מבוצע על כל דם טרי למנות אוכלוסיות מולד אדפטיבית עיקריות יקוציט. אנו מדגישים שיקולים לביצוע הליכים אלה בהקשר של ניסוי קליני רב מרכזי.
Abstract
Cryopreservation של לויקוציטים דם ההיקפי נמצא בשימוש נרחב לשימור תאים להערכות תגובה חיסוניות בניסויים קליניים, ומציע יתרונות רבים לנוחות וסטנדרטיזציה של הערכות חיסוניות, אך השפעות מזיקות של תהליך זה נצפה בכמה תת קבוצות של תאים, כגון גרנולוציטים, תאי B , ותאים דנדריטיים 1-3. Assaying לויקוציטים הטרי נותן תמונה מדויקת יותר של המצב בvivo של התאים, אבל לעתים קרובות קשה לביצוע בהקשר של ניסויים קליניים גדולים. מבחני תא טריים תלויים התחייבויות התנדבות ולוחות זמנים, ואם זמן רב, היישום שלהם יכול להיות מעשי בשל שעתי העבודה הנדרשות מאנשי מעבדה. בנוסף, כאשר ניסויים נערכים במרכזים מרובים, מעבדות עם המשאבים וההכשרה הדרושים כדי לבצע את המבחנים לא יכולות להיות ממוקמות בקרבה מספיקה לאתרים קליניים. כדי לטפל בבעיות אלה, יש לנו develלאומי למטרולוגיה חוקית פנל מכתים נוגדנים 11-צבע שניתן להשתמש בו עם Trucount צינורות (הקיטון דיקינסון, סן חוזה, קליפורניה) לפנוטיפ ולמנות את אוכלוסיות ליקוציט מרכזיות בתוך הדם ההיקפי, מניב מידע ספציפי תא מסוג חזק יותר ממבחנים כגון ספירת דם מלא (CBC) או מבחנים עם לוחות, זמינים מסחריים המיועדים לצינורות Trucount שמכתימים אותו רק לכמה סוגי תאים. הליך ההכתמה הוא פשוט, דורש רק 100 μl של כל דם טרי, ולוקח כ 45 דקות, מה שהופך את זה אפשרי עבור מעבדות סטנדרטיות דם לעיבוד שיש לבצע. זה מותאם מגיליון BD Trucount צינור הנתונים הטכני (גרסה 8/2010). קוקטייל הנוגדן המכתים יכול להיות מוכן מראש בכמויות גדולות במעבדת assay מרכזית ונשלח למעבדה לעיבוד באתר. צינורות מוכתמים ניתן לתקןוקפא למשלוח למעבדת הבדיקה המרכזית לניתוח cytometry זרימה ססגונית. נתונים המופקים מפנל מכתים זה יכול לשמש כדי לעקוב אחר שינויים בריכוזים ליקוציט לאורך הזמן ביחס להתערבות ויכול היה בקלות להיות מפותח יותר להעריך מצבי הפעלה של סוגי תאים ספציפיים של עניין. בדו"ח זה, אנו מדגימים את התהליך בשימוש על ידי טכנאי מעבדת דם עיבוד לבצע צביעה על כל דם טרי ואת הצעדים כדי לנתח דגימות מוכתמות אלה במעבדת assay מרכזית תומכת בניסוי קליני רב מרכזי. פרטי וידאו ההליך כפי שהוא מתבצע בהקשר של תיקו דם ניסוי קליני בחיסון ה-HIV משפטי הרשת (HVTN).
Protocol
Discussion
בדו"ח זה, אנו מציגים שיטת חרוז מבוססת על ספירת אוכלוסיות שלמות ליקוציט בדם טרי על ידי cytometry זרימה ולכסות את הפרמטרים דרושים לשימוש בו בניסוי קליני רב מרכזי בניתוח מדגם ריכוזי. שיטה זו מתבססת על ומייעלת את פרוטוקול Trucount BD ומאפשר השימוש האמין שלה בהגדרת ניסוי רב מרכז?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים ג'סיקה ג'ונס, אריקה קלארק, קונסטנס Ducar, דון סמית, רוי לואיס, לילי Apedaile, ג'ואן ויזנר, דווין אדאמס, הקורים McBain וסטיבן Voght על עזר בפיתוח של שיטה, וכתב יד בסרטון זה.
עבודה זו נתמכה על ידי קרן ביל ומלינדה גייטס CAVD מענק 38645 (MJM) ומכונים הלאומיים לבריאות מענקי UM1 AI068618 וU01 AI069481 (MJM). EA-N. הוא נתמך על ידי NIH גרנט T32 AI007140. אנו מודים לקרן ג'יימס ב 'פנדלטון צדקה לתרומת ציודם הנדיבה.
Materials
| Reagent Name | Company | Catalogue number |
| Trucount Absolute Counting Tubes | BD Biosciences | 340334 |
| 10X FACS Lysing Solution | BD Biosciences | 349202 |
| Category B & Exempt Shipping System, Insulated | Saf-T-Pak | STP-320 |
| CD45 AmCyan monoclonal antibody | BD Biosciences | 339192 |
| CD3 FITC monoclonal antibody | BD Biosciences | 349201 |
| CD8 PerCp-Cy 5.5 monoclonal antibody | BD Biosciences | 341051 |
| CD4 Alexa Fluor 700 monoclonal antibody | BD Biosciences | 557922 |
| HLA-DR ECD monoclonal antibody | Beckman Coulter | IM3636 |
| CD14 v450 monoclonal antibody | BD Biosciences | 560349 |
| CD19 PE monoclonal antibody | BD Biosciences | 555413 |
| CD16 APC-H7 monoclonal antibody | BD Biosciences | 560195 |
| CD56 PE-Cy7 monoclonal antibody | BD Biosciences | 335791 |
| CD11c APC monoclonal antibody | BD Biosciences | 559877 |
| CD123 PE-Cy5 monoclonal antibody | BD Biosciences | 551065 |
References
- Taylor, M. J., London, N. J., Thirdborough, S. M., Lake, S. P., James, R. F. The cryobiology of rat and human dendritic cells: preservation and destruction of membrane integrity by freezing. Cryobiology. 27, 269-278 (1990).
- Reimann, K. A., Chernoff, M., Wilkening, C. L., Nickerson, C. E., Landay, A. L. Preservation of lymphocyte immunophenotype and proliferative responses in cryopreserved peripheral blood mononuclear cells from human immunodeficiency virus type 1-infected donors: implications for multicenter clinical trials. The ACTG Immunology Advanced Technology Laboratories. Clin Diagn Lab Immunol. 7, 352-359 (2000).
- Boonlayangoor, P., Telischi, M., Boonlayangoor, S., Sinclair, T. F., Millhouse, E. W. Cryopreservation of human granulocytes: study of granulocyte function and ultrastructure. Blood. 56, 237-245 (1980).
- Perfetto, S. P., Ambrozak, D., Nguyen, R., Chattopadhyay, P., Roederer, M. Quality assurance for polychromatic flow cytometry. Nat Protoc. 1, 1522-1530 (2006).
- Brando, B., Barnett, D., Janossy, G., Mandy, F., Autran, B., Rothe, G., Scarpati, B., D’Avanzo, G., D’Hautcourt, J. L., Lenkei, R., Schmitz, G., Kunkl, A., Chianese, R., Papa, S., Gratama, J. W. Cytofluorometric methods for assessing absolute numbers of cell subsets in blood. European Working Group on Clinical Cell Analysis. Cytometry. 42, 327-346 (2000).
- Bull, M., Lee, D., Stucky, J., Chiu, Y. L., Rubin, A., Horton, H., McElrath, M. J. Defining blood processing parameters for optimal detection of cryopreserved antigen-specific responses for HIV vaccine trials. J. Immunol Methods. 322, 57-69 (2007).
- Kantor, A. B., Roederer, M., Herzenberg, L., Blackwell, C., Weir, D. . The handbook of Experimental Immunology. 43, 1-49 (1996).
- Hulspas, R. Flow cytometry and the stability of phycoerythrin-tandem dye conjugates. Cytometry A. 75, 966-972 (2009).
- Le Roy, C., Varin-Blank, N., Ajchenbaum-Cymbalista, F., Letestu, R. Flow cytometry APC-tandem dyes are degraded through a cell-dependent mechanism. Cytometry A. 75, 882-890 (2009).
- Mandy, F., Brando, B. Enumeration of absolute cell counts using immunophenotypic techniques. Curr. Protoc. Cytom. Chapter 6, Unit 6 (2001).
- Vuckovic, S. Monitoring dendritic cells in clinical practice using a new whole blood single-platform TruCOUNT assay. J. Immunol Methods. 284, 73-87 (2004).
- Lichtner, M. Circulating dendritic cells and interferon-alpha production in patients with tuberculosis: correlation with clinical outcome and treatment response. Clin. Exp. Immunol. 143, 329-337 (2006).
- Hosmalin, A., Lichtner, M., Louis, S. Clinical analysis of dendritic cell subsets: the dendritogram. Methods Mol. Biol. 415, 273-290 (2008).
