Opsomming van belangrijke perifeer bloed leukocyten populaties voor Multicenter klinische proeven met behulp van een volbloed Fenotypering Assay
Summary
In dit rapport tonen we de kleuring en analyse stappen van een fenotypering test uitgevoerd op vers volbloed aan grote aangeboren en adaptieve leukocyten populaties te sommen. Wij benadrukken overwegingen voor het uitvoeren van deze procedures in het kader van een multicenter klinische studie.
Abstract
Cryopreservatie van perifeer bloed leukocyten wordt op grote schaal gebruikt om cellen voor immune reactie evaluaties te bewaren in klinische studies en biedt vele voordelen voor het gemak en de standaardisatie van immunologische evaluaties, maar nadelige effecten van dit proces zijn waargenomen op sommige cel subsets, zoals granulocyten, B-cellen en dendritische cellen 1-3. Analyseren verse leukocyten geeft een nauwkeuriger beeld van de in vivo toestand van de cellen, maar is vaak moeilijk uit te voeren in het kader van grote klinische studies. Verse cel assays zijn afhankelijk van vrijwilligers verplichtingen en termijnen, en zo tijdrovend, die toepassing niet kan onpraktisch zijn als gevolg van de werktijden nodig zijn van het laboratoriumpersoneel. Bovendien, als proeven worden uitgevoerd op meerdere centra, kunnen de laboratoria met de middelen en opleiding nodig zijn om de tests uit te voeren niet in voldoende nabijheid van klinische plaatsen. Om deze problemen aan te pakken, hebben we ontwikkeld een 11-kleurige antilichaamkleuring paneel dat kan met Trucount buizen (Becton Dickinson, San Jose, CA) gebruikt om fenotype en grote sommen leukocyt populaties in het perifere bloed, waardoor robuuster celtype specifieke informatie dan assays zoals complete bloedbeeld (CBC) of testen met de handel verkrijgbare panelen ontworpen voor Trucount buizen die vlek voor slechts een paar soorten cellen. De kleuring procedure is eenvoudig, vereist slechts 100 ul vers volbloed, en duurt ongeveer 45 minuten, waardoor het mogelijk is voor standaard bloed-processing laboratoria uit te voeren. Het is een bewerking van de BD Trucount buis technische fiche ( versie 8/2010 ). De kleuring antilichaam cocktail worden voorbereid in bulk in een centraal laboratorium assay en overgebracht naar de verwerking ter labs. Stained buizen kunnen worden vastgestelden ingevroren voor verzending naar de centrale test laboratorium voor veelkleurige flowcytometrie-analyse. De gegevens die uit deze kleuring paneel kan worden gebruikt om veranderingen in concentraties leukocyten tijd met betrekking tot interventie volgen en gemakkelijk verder worden ontwikkeld om activatie toestand van specifieke celtypen plaats beoordelen. In dit rapport tonen we de procedure die door bloed-processing laboranten om vlekken uit te voeren op vers volbloed en de stappen om deze gekleurde monsters te analyseren op een centrale test laboratorium ter ondersteuning van een multicenter klinische studie. De video beschrijft de procedure zoals deze wordt uitgevoerd in het kader van een klinische proef bloed trekken in de HIV Vaccine Trials Network (HVTN).
Protocol
Discussion
In dit rapport presenteren we een kraal-gebaseerde methode voor het opsommen van leukocyten populaties in vers volbloed door flowcytometrie en hebben betrekking op de parameters die nodig zijn voor het gebruik ervan in een multicenter klinische studie met gecentraliseerde monsteranalyse. Deze methode is gebaseerd op en optimaliseert de BD Trucount protocol en maakt het zijn betrouwbaar gebruik in een multicenter klinische studie setting. De kleuring test is eenvoudig en duurt ongeveer 45 minuten uit te voeren, waardoor …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij danken Jessica Jones, Erica Clark, Constance Ducar, Donna Smith, Roy Lewis, Lily Apedaile, Joanne Wiesner, Devin Adams, Corey McBain en Stephen Voght voor hun hulp bij de ontwikkeling van deze methode, manuscript en video.
Dit werk werd ondersteund door de Bill en Melinda Gates Foundation CAVD subsidie 38.645 (MJM) en National Institutes of Health subsidies UM1 AI068618 en U01 AI069481 (MJM). EA-N. wordt ondersteund door NIH Grant T32 AI007140. Wij danken de James B. Pendleton Charitable Trust voor hun genereuze uitrusting donatie.
Materials
| Reagent Name | Company | Catalogue number |
| Trucount Absolute Counting Tubes | BD Biosciences | 340334 |
| 10X FACS Lysing Solution | BD Biosciences | 349202 |
| Category B & Exempt Shipping System, Insulated | Saf-T-Pak | STP-320 |
| CD45 AmCyan monoclonal antibody | BD Biosciences | 339192 |
| CD3 FITC monoclonal antibody | BD Biosciences | 349201 |
| CD8 PerCp-Cy 5.5 monoclonal antibody | BD Biosciences | 341051 |
| CD4 Alexa Fluor 700 monoclonal antibody | BD Biosciences | 557922 |
| HLA-DR ECD monoclonal antibody | Beckman Coulter | IM3636 |
| CD14 v450 monoclonal antibody | BD Biosciences | 560349 |
| CD19 PE monoclonal antibody | BD Biosciences | 555413 |
| CD16 APC-H7 monoclonal antibody | BD Biosciences | 560195 |
| CD56 PE-Cy7 monoclonal antibody | BD Biosciences | 335791 |
| CD11c APC monoclonal antibody | BD Biosciences | 559877 |
| CD123 PE-Cy5 monoclonal antibody | BD Biosciences | 551065 |
References
- Taylor, M. J., London, N. J., Thirdborough, S. M., Lake, S. P., James, R. F. The cryobiology of rat and human dendritic cells: preservation and destruction of membrane integrity by freezing. Cryobiology. 27, 269-278 (1990).
- Reimann, K. A., Chernoff, M., Wilkening, C. L., Nickerson, C. E., Landay, A. L. Preservation of lymphocyte immunophenotype and proliferative responses in cryopreserved peripheral blood mononuclear cells from human immunodeficiency virus type 1-infected donors: implications for multicenter clinical trials. The ACTG Immunology Advanced Technology Laboratories. Clin Diagn Lab Immunol. 7, 352-359 (2000).
- Boonlayangoor, P., Telischi, M., Boonlayangoor, S., Sinclair, T. F., Millhouse, E. W. Cryopreservation of human granulocytes: study of granulocyte function and ultrastructure. Blood. 56, 237-245 (1980).
- Perfetto, S. P., Ambrozak, D., Nguyen, R., Chattopadhyay, P., Roederer, M. Quality assurance for polychromatic flow cytometry. Nat Protoc. 1, 1522-1530 (2006).
- Brando, B., Barnett, D., Janossy, G., Mandy, F., Autran, B., Rothe, G., Scarpati, B., D’Avanzo, G., D’Hautcourt, J. L., Lenkei, R., Schmitz, G., Kunkl, A., Chianese, R., Papa, S., Gratama, J. W. Cytofluorometric methods for assessing absolute numbers of cell subsets in blood. European Working Group on Clinical Cell Analysis. Cytometry. 42, 327-346 (2000).
- Bull, M., Lee, D., Stucky, J., Chiu, Y. L., Rubin, A., Horton, H., McElrath, M. J. Defining blood processing parameters for optimal detection of cryopreserved antigen-specific responses for HIV vaccine trials. J. Immunol Methods. 322, 57-69 (2007).
- Kantor, A. B., Roederer, M., Herzenberg, L., Blackwell, C., Weir, D. . The handbook of Experimental Immunology. 43, 1-49 (1996).
- Hulspas, R. Flow cytometry and the stability of phycoerythrin-tandem dye conjugates. Cytometry A. 75, 966-972 (2009).
- Le Roy, C., Varin-Blank, N., Ajchenbaum-Cymbalista, F., Letestu, R. Flow cytometry APC-tandem dyes are degraded through a cell-dependent mechanism. Cytometry A. 75, 882-890 (2009).
- Mandy, F., Brando, B. Enumeration of absolute cell counts using immunophenotypic techniques. Curr. Protoc. Cytom. Chapter 6, Unit 6 (2001).
- Vuckovic, S. Monitoring dendritic cells in clinical practice using a new whole blood single-platform TruCOUNT assay. J. Immunol Methods. 284, 73-87 (2004).
- Lichtner, M. Circulating dendritic cells and interferon-alpha production in patients with tuberculosis: correlation with clinical outcome and treatment response. Clin. Exp. Immunol. 143, 329-337 (2006).
- Hosmalin, A., Lichtner, M., Louis, S. Clinical analysis of dendritic cell subsets: the dendritogram. Methods Mol. Biol. 415, 273-290 (2008).
