Una técnica de imagen para el monitoreo de los cambios de potencial de membrana con una resolución temporal sub-micrométrico espacial y sub-milisegundos es descrito. La técnica, basado en una excitación láser de colorantes sensibles a voltaje, permite realizar mediciones de señales en los axones y colaterales axónicas, ramas terminales individuales dendríticas, y las espinas dendríticas.
Entender las propiedades biofísicas y la organización funcional de las neuronas individuales y la forma en que procesan la información es fundamental para la comprensión de cómo funciona el cerebro. La función principal de cualquier célula nerviosa es para procesar señales eléctricas, por lo general de múltiples fuentes. Propiedades eléctricas de los procesos neuronales son extraordinariamente complejos, dinámicos y, en el caso general, imposible de predecir en ausencia de mediciones detalladas. Para obtener una medición de uno lo haría, idealmente, como para ser capaz de controlar, en múltiples sitios, eventos subumbral medida que viajan desde los sitios de origen de los procesos neuronales y summate en determinados lugares para la iniciación del potencial de acción. Este objetivo no se ha alcanzado en cualquier neurona debido a las limitaciones técnicas de mediciones que emplean electrodos. Para superar este inconveniente, es altamente deseable para complementar el enfoque parche de electrodo con técnicas de imagen que permiten recordin paralelo extensags de todas partes de una neurona. A continuación, describimos una técnica – grabación óptica de los transitorios de potencial de membrana con orgánicos tintes sensibles al voltaje (V m-imaging) – caracterizadas por sub-milisegundos y resolución sub-micrométrico. Nuestro método se basa en el trabajo pionero sobre sensibles al voltaje sondas moleculares 2. Muchos aspectos de la tecnología inicial han sido continuamente mejorado a lo largo de varias décadas 3, 5, 11. Además, el trabajo previo documentado dos características esenciales de la V m-imágenes. En primer lugar, las señales de fluorescencia son linealmente proporcional al potencial de membrana en todo el rango fisiológico (-100 mV a +100 mV; 10, 14, 16). En segundo lugar, las neuronas de carga con el colorante sensible al voltaje utilizado aquí (JPW 3028) no tiene efectos farmacológicos detectables. La ampliación grabado de la espiga durante la carga de colorante es completamente reversible 4, 7. Además, la evidencia experimental muestra que es posible obtenerun número significativo (hasta cientos) de grabaciones antes de cualquier efecto detectables fototóxicas 4, 6, 12, 13. En la actualidad, se toma ventaja de la excelente brillo y la estabilidad de una fuente de luz láser a la longitud de onda casi óptimo para maximizar la sensibilidad de la V m técnica de imagen. La sensibilidad actual permite realizar varias grabaciones sitio ópticas de V m transitorios de todas partes de una neurona, incluyendo los axones y colaterales del axón, ramas terminales dendríticas, y las espinas dendríticas individuales. La información adquirida en las interacciones de la señal puede ser analizada cuantitativamente, así como visualizar directamente en la forma de una película.
En este artículo se describe un método de tintura sensible al voltaje de grabación para monitorear la actividad eléctrica de las neuronas individuales con sub-micrométrico y sub-milisegundos resolución espacio-temporal. Excitación con láser en casi óptimo de longitud de onda (en cuanto al tamaño de la señal) mejoró la sensibilidad de grabación en un factor de ~ 50 sobre los enfoques anteriores. La sensibilidad actual permite monitorizar señales eléctricas de todas las partes de las neuronas individuales, …
The authors have nothing to disclose.
Estamos muy agradecidos a nuestros colaboradores Knut Holthoff, Konnerth Arthur y Canepari Marco, que participó en el desarrollo inicial de esta técnica, así como a Leslie M. Loew para proporcionar la amabilidad de los tintes. Con el apoyo de NSF subvención IOS-0817969, el NIH subvenciones NS068407 y M136043 y por Instituto Kavli de Neurociencia en la Universidad de Yale.
Name of the component | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
Setup components | |||
Upright Microscope | Olympus Inc. | BX51WI | With three camera ports |
Motorized Movable Stage | Siskiyou | MXOPi.2 | |
Epi-fluorescence Condenser for Olympus BX51 | TILL Photonics | 0000-560-11659 | |
Upright Microscope | Carl Zeiss, LLC | AxioExaminer D1 | With three camera ports |
Motorized Top Plate | Scientifica Limited | MMBP | |
Epi-fluorescence Condenser for Zeiss AxioExaminer | TILL Photonics | ||
Data Acquisition Camera | RedShirtImaging LLC | NeuroCCD-SM | High speed, low read noise |
CCD for IR-DIC | Dage-MTI | IR-1000 | |
Spinning-Disc Confocal Scanner | Yokogawa | CSU-10 | |
High Spatial Resolution CCD on Confocal Scanner | PCO AG | PixelFly | 1392×1024 pixels |
DPSS CW Laser (532 Nm) | CNI Optoelectronics Tech. Co., Ltd | MLL-III-532 400mW | Excitation light source |
Multi-Mode Fiber Launcher | Siskiyou | SM-CFT | |
Light Guide | TILL Photonics | 0000-515-11524 | |
Shutter | Vincent Associates | LS6 | |
Vibration Isolation Table | Minus k Technology | MK26 | |
Specific reagents | |||
Di-2-ANEPEQ (JPW 1114) | Life Technologies | D-6923 | Voltage sensitive dye |
Crym-EGFP Mouse Line | GENSAT (MMRRC) | STOCK Tg(Crym-EGFP)GF82Gsat/Mmcd | Sparsely expressing EGFP in Layer 5 cortical neurons |