Rápido aislamiento de células tumorales viables de circulación de muestras de sangre del paciente

El protocolo siguiente es para la producción de un dispositivo microtubo clave. 1. Preparación de la solución de nanotubos de halloysita Baño de ultrasonidos (10-13 W (RMS)) 250 l solución de nanotubos de halloysita (6,6% en peso en agua) 30 seg. Solución de enfriamiento con agua fría y ultrasonidos repetir una vez. Enfriar de nuevo. Dibujar solución sonicado en una jeringa, colocar un filtro de 0,45 micras jeringa, y solución de filtro en el tubo de microcentrífuga limpio. Vortex la solución ocasionalmente para mantener la homogeneidad. 2. El recubrimiento de la superficie interior con microtubos de nanotubos de halloysita Obtener 50 cm de sección larga de la Micro-Renathane microtubing (300 m de diámetro interior, 35,3 l volumen interior). Corte un extremo del microtubo en una diagonal y se insertan en un pedazo pequeño adaptador IDEX. Insertar la aguja de una jeringa 3/10 cc 29G en el otro extremo del microtubo. Para limpiar el microtubo, colocar el extremo abierto del microtubo (el extremocon el adaptador) en etanol al 70% y un empate ~ 50 l de etanol en la jeringa para llenar microtubo. Lavar el etanol a partir del microtubo dibujando un volumen suficiente de agua destilada en la jeringa. Retire la jeringa del microtubo, vaciar la jeringa, y luego vuelva a colocar en el microtubo. Preparar una solución de 0,02% w / v de poli-L lisina en agua. Extraer 50 l en el microtubo y dejar reposar durante 5 min a temperatura ambiente (TA). Dibuja 100 l solución filtrada de nanotubos en el microtubo y dejar incubar durante 3 min a temperatura ambiente. Dibuja de agua de 100 l por el microtubo para enjuagar la solución de nanotubos. Permitir microtubo recubierto para sentarse, lleno de agua, durante la noche a temperatura ambiente. 3. Preparación de Microtubos para el aislamiento de la célula Preparar una solución de 10 mg / ml de proteínas G en fosfato 1X Dulbecco (PBS, pH 7,0 a 7,2). Extraer 50 l de PBS a través microtubo y luego dibujar 50 l dela solución de proteína-G y permitir a incubar durante 1,5 horas a temperatura ambiente. Prepare una solución que contenía 5 mg / mL de E-selectina-IgG y 50 ug / ml de anticuerpos (anti-EpCAM para las muestras de cáncer de la mayoría de los anti-PSMA de muestras de cáncer de la próstata) en PBS. Extraer 50 L de la E-selectina y solución de anticuerpos en el microtubo y dejar incubar durante 2 horas a temperatura ambiente. Adhesión celular no específica se bloquearon con proteínas de la leche al 5%. Preparar una solución de 5% (w / v) de proteína de la leche en PBS. Dibujar 50 l solución proteína de la leche en el microtubo y permitir a incubar durante 1 hora a temperatura ambiente. Extraer 50 l de PBS en el tubo y dejar a temperatura ambiente hasta que las muestras de sangre o de la capa leucocitaria están listos para su procesamiento. 10 minutos antes de usar el microtubo para el aislamiento, dibujar 50 l de PBS que ha sido saturada con Ca 2 + ("PBS +") para activar las moléculas de selectina. 4. Preparación de muestras para el aislamiento de células Dibujar o obtener 10 ml de sangre del paciente en heparinizadatubo. Colocar 10 ml de Ficoll-Paque solución de aislamiento de linfocitos en 50 ml tubo de centrífuga. Suavemente la capa 10 ml de sangre entera en la parte superior de Ficoll para que no se mezcle la sangre y Ficoll. Se centrifuga a 2000x g durante 15 min a 4 ° C con una desaceleración mínima. Retire la capa de la capa leucocitaria y el lugar en el nuevo tubo. Lavado de la capa leucocitaria con PBS (centrifuga a 230x g durante 10 minutos, descartar el sobrenadante). Resuspender las células con 1 ml de solución amortiguadora de lisis de glóbulos rojos y se incuba durante 10 min a temperatura ambiente para lisar los eritrocitos. Añadir 10 ml de PBS, mezclar suavemente, y se centrifuga a 230x g durante 10 minutos. Eliminar el sobrenadante y resuspender el precipitado con cuidado en 3 a 4 ml de PBS +. 5. Celda de aislamiento Conecte un extremo del microtubo funcionalizado a una jeringa de 5 ml con adaptadores de IDEX. Insertar la jeringa en una bomba de jeringa. Sumergir el extremo abierto del microtubo funcionalizado en la célula suspension. Procesar la suspensión celular a través de la microtubo de 1 a 4 ml / h. Transferir el extremo abierto del microtubo a un tubo que contenía PBS + y dibujar 300 L + PBS en jeringa a 0,016 ml / min para eliminar las células no unido y débilmente ligados desde el microtubo. Coloque el extremo abierto del microtubo en un tubo limpio. Desconecte la jeringa del microtubo y adjuntar una jeringa precargada con Accutase. Suavemente perfundir Accutase suficiente en el microtubo para llenar (~ 50 l) y se deja incubar a temperatura ambiente durante 10 minutos. Coloque una jeringa precargada con 1 ml de medio de crecimiento (79% de RPMI, FBS al 20%, 1% de penicilina estreptomicina) y perfundir en microtubo, recogiendo efluente en cultivo de tejidos tratados bien placa. Las células de cultivo a 37 ° C y 5% de CO 2 bajo condiciones de humedad. 6. Los resultados representativos El objetivo de esta técnica consiste en aislar células viables de cáncer de la sangre de pacientes con cáncer. Existen varios métodos para identificar las células cancerosas en la cultura, la verificación necesaria para el éxito del dispositivo. Hemos elegido para teñir las células en cultivo con anticuerpos contra restos epiteliales tales como EpCAM (molécula de adhesión celular epitelial) o PSMA (antígeno prostático específico de membrana), además de DAPI para identificar los núcleos de células intactas (Fig. 2 y 3). El número de células cancerosas capturados utilizando esta técnica es necesariamente una función del número de CTC en la muestra de partida, y la variabilidad del paciente puede ser alto. En el procesamiento de las muestras tomadas de pacientes diagnosticados con cáncer en estadio IV, que habitualmente capturan entre 100 y 500 células cancerosas por el tubo de sangre, en el grado de pureza> 50%. Inmediatamente después de aislamiento, un mayor número de leucocitos contaminantes pueden estar presentes. Sin embargo, estos números se agota después de incubación en medio de cultivo durante un máximo de 5 días. <strong> Figura 1. Esquema de microtubo funcionalizado para el aislamiento de la CTC, mostrando selectina mediada por laminación seguido mediada por anticuerpos adhesión estática. Figura 2. Los datos representativos de aislamiento CTC de muestras de sangre extraídas de un paciente con cáncer de mama y un paciente de cáncer de pulmón. El número de células viables positivamente identificados como CTC basado en la tinción EpCAM está representado por las barras de sólidos y se refieren a la ordenada izquierda y el porcentaje de células que fueron identificadas como CTC en comparación con el número total de células capturadas está representado por las barras abiertas y medido en la ordenada derecha. Los resultados son los siguientes cinco días de cultivo. Figura 3. Micrografías representativas de los donantes separados (A y B) de CTC en la cultura 5 días posteriores a isolatien una muestra de cáncer de la sangre del paciente. Las células fueron teñidas con fluorescencia para EpCAM con AlexaFluor 488 (verde) y 4 ',6-diamino-2-phenylindole (DAPI) para visualizar el núcleo (azul).