Isolamento rapido di cellule tumorali circolanti da campioni di sangue del paziente

Il protocollo seguito è per la produzione di un dispositivo microtubo singolo. 1. Preparazione della soluzione Nanotubi Halloysite Sottoporre ad ultrasuoni (10-13 W (rms)) 250 microlitri soluzione di nanotubi halloysite (6,6% in peso in acqua) 30 sec. Soluzione di raffreddare con acqua fredda e sonicazione ripetere una sola volta. Raffreddare di nuovo. Disegna la soluzione sonicato in una siringa, collegare un filtro per siringa 0,45 micron, e la soluzione di filtro in provetta per microcentrifuga pulita. Vortex la soluzione di tanto in tanto per mantenere l'omogeneità. 2. Rivestimento di superficie Conetti interno con nanotubi halloysite Ottenere 50 cm lungo tratto di Micro-Renathane microtubing (300 micron di diametro interno, 35,3 microlitri di volume interno). Tagliare un'estremità della provetta in diagonale e inserire in un piccolo pezzo adattatore IDEX. Inserire l'ago di una siringa 3/10 cc 29G nell'altra estremità della provetta. Per pulire la provetta, posizionare l'estremità aperta della provetta (finecon l'adattatore) in etanolo al 70% e il pareggio ~ 50 microlitri di etanolo nella siringa per riempire provetta. Sciacquare la produzione di etanolo da provetta disegnando un volume generoso di acqua distillata nella siringa. Staccare la siringa dal microprovetta, svuotare la siringa, e quindi ricollegare alla provetta. Preparare una soluzione di 0,02% w / v poli L-lisina in acqua. Disegnare 50 pl nella provetta e lasciare riposare per 5 min a temperatura ambiente (RT). Disegnare 100 ul di soluzione nanotubo filtrata nella provetta e consentire ad incubare per 3 minuti a RT. Disegnare 100 microlitri di acqua attraverso la provetta per sciacquare la soluzione nanotubo. Lasciare microprovetta rivestito di sedersi, riempita con acqua, durante la notte a temperatura ambiente. 3. Preparazione di Microtubes per l'isolamento cellulare Preparare una soluzione di 10 ug / mL proteina G in fosfato di Dulbecco 1X salina tamponata (PBS, pH 7,0 – 7,2). Disegnare 50 microlitri di PBS attraverso provetta e quindi disegnare 50 pl dila proteina-G soluzione e consentono di incubare per 1,5 ore a temperatura ambiente. Preparare una soluzione contenente 5 pg / mL E-selectina-IgG e 50 ug / ml di anticorpo (anti-EpCAM per la maggior parte dei campioni di cancro, anti-PSMA per campioni di cancro della prostata) in PBS. Estrarre 50 pl della E-selectina e la soluzione di anticorpi nella provetta e permettono di incubare per 2 ore a temperatura ambiente. Non specifica adesione cellulare è bloccato con le proteine ​​del latte del 5%. Preparare una soluzione di 5% (w / v), proteine ​​del latte in PBS. Estrarre 50 pl soluzione di proteina del latte nella provetta e consentire ad incubare per 1 ora a RT. Disegnare 50 microlitri di PBS nella provetta e lasciare a temperatura ambiente fino a quando i campioni di sangue o cappotto buffy sono pronti per l'elaborazione. 10 min prima di utilizzare il microprovetta per l'isolamento, disegnare 50 pl PBS che è stato saturato con Ca 2 + ("PBS +") per attivare le molecole selectina. 4. Preparazione dei campioni per l'isolamento delle cellule Disegnare o ottenere 10 mL di sangue dal paziente in eparinizzatotubo. Place 10 mL Ficoll-Paque soluzione di isolamento dei linfociti in tubo da 50 ml centrifuga. Delicatamente sangue intero strato 10 mL sopra Ficoll per non mescolare il sangue e Ficoll. Centrifugare a 2000x g per 15 min a 4 ° C con decelerazione minima. Rimuovere lo strato di rivestimento buffy e il luogo in nuova provetta. Lavare il buffy coat con PBS (centrifugare a 230x g per 10 min, scartare il surnatante). Risospendere delicatamente le cellule con 1 ml di tampone di lisi RBC e incubare per 10 min a RT per la lisi degli eritrociti. Aggiungere 10 ml di PBS, mescolare delicatamente e centrifugare a 230x g per 10 min. Eliminare il supernatante e risospendere delicatamente il pellet in 3 a 4 mL PBS +. 5. Cella di isolamento Collegare una estremità della provetta funzionalizzato ad una siringa da 5 ml con adattatori IDEX. Inserire la siringa su una pompa a siringa. Immergere l'estremità aperta della provetta funzionalizzato nella cella suspension. Elabora la sospensione cellulare attraverso la provetta a 1 a 4 mL / h. Trasferire l'estremità aperta della provetta in una provetta contenente PBS + 300 + e disegnare ul PBS nella siringa a 0,016 mL / min per rimuovere le cellule non legato e vagamente legate dalla provetta. Posizionare l'estremità aperta della provetta in una provetta pulita. Staccare la siringa dal microprovetta e allegare una siringa preriempita con Accutase. Delicatamente perfusione Accutase abbastanza in provetta da riempire (~ 50 mL) e lasciar incubare a temperatura ambiente per 10 min. Attaccare una siringa preriempita con 1 mL di mezzo di crescita (79% RPMI, FBS 20%, streptomicina 1% di penicillina) e profumato in provetta, raccogliendo effluente in coltura di tessuto trattati bene piastra. Cellule di coltura a 37 ° C e 5% CO 2 in condizioni umidificati. 6. Risultati rappresentativi L'obiettivo di questa tecnica è quella di isolare cellule tumorali vitali dal sangue di pazienti affetti da cancro. Esistono diversi metodi per identificare le cellule tumorali in coltura, una verifica necessaria di successo dispositivo. Abbiamo scelto per colorare le cellule in coltura con anticorpi contro porzioni epiteliali come EpCAM (molecola di adesione cellulare epiteliale) o PSMA (antigene di membrana specifico della prostata), oltre a DAPI per identificare nuclei intatti cellule (Fig. 2 e 3). Il numero di cellule tumorali catturato utilizzando questa tecnica è necessariamente una funzione del numero di CTC nel campione iniziale, e la variabilità del paziente può essere elevato. Nel trattamento di campioni prelevati da pazienti con diagnosi di tumori stadio IV, che abitualmente catturano tra 100 e 500 cellule tumorali per provetta di sangue, a purezze> 50%. Immediatamente dopo isolamento, un maggior numero di leucociti contaminanti possono essere presenti. Tuttavia, questi numeri saranno esaurite incubazione seguente terreno di coltura per un massimo di 5 giorni. <strong> Figura 1. Schema della provetta funzionalizzata per l'isolamento CTC, mostrando selectina-mediata rotolamento seguito da anticorpo-mediata adesione statica. Figura 2. Dati rappresentativi di isolamento CTC da campioni di sangue prelevato da un paziente cancro al seno e un malato di cancro ai polmoni. Il numero di cellule vitali identificabili come CTC base colorazione EpCAM è rappresentato dalle barre solide e riguardano l'ordinata di sinistra e la percentuale di cellule che sono stati identificati come CTC rispetto al numero totale di cellule catturate è rappresentato dalle barre aperte e misurato sulla ordinata di destra. I risultati vengono dopo cinque giorni di coltura. Micrografie rappresentativi Figura 3. Da donatori diversi (A e B) della CTC nella cultura 5 giorni successivi alla intercettaza partire da un campione di sangue del paziente cancro. Le cellule sono state colorate per fluorescenza con EpCAM AlexaFluor 488 (verde) e 4 ',6-Diamidino-2-fenilindolo (DAPI) per visualizzare il nucleo (blu).