从病人的血液样本可行的循环肿瘤细胞的快速分离

下面的协议是一个单一的微管设备的生产。 1。埃洛石纳米管溶液的制备超声粉碎（10-13 W（RMS））250μL，埃洛石纳米管溶液（6.6 wt％的水）30秒。用冷水重复超声一次冷静的解决方案。降温再次。 绘制到一个注射器超声波处理解决方案，将用0.45μm注射器过滤器，过滤成干净的离心管的解决方案。涡的解决方案偶尔保持同质。 2。埃洛石纳米管与微管内表面涂层获得50厘米长的路段（300微米内径35.3μL积）微Renathane microtubing的。在对角线切割微管的一端插入小艺达思适配器一块。 29G的3/10毫升注射器针头插入另一端的微管。 要清理的微管，放置微管的开口端（结束适配器）到70％的乙醇和抽奖〜50μL注射器进入乙醇来填补微管。 乙醇冲洗出来的微管抽入注射器大方量的蒸馏水。 脱离微管的注射器，注射器清空，然后重新连接到微管。 准备一个0.02％W / V聚L赖氨酸在水中的解决方案。成微管吸取50微升，并允许在室温（RT）5分钟坐。 微管吸引到100μL的过滤碳纳米管的解决方案，允许3分钟在室温下孵育。 冲洗出来的碳纳米管溶液通过微管吸取100μL水。允许涂层微管坐，装满水，在室温下过夜。 3。微管细胞分离制备准备解决的10微克/毫升杜尔贝科1X的磷酸盐G蛋白缓冲液（PBS，pH值7.0 – 7.2）。通过微管绘制为50μLPBS和然后吸取50μL的蛋白-G的解决方案，并允许在室温下为1.5小时孵化。 含5μg/ mL的E – 选择素IgG和50μg/ ml的抗体（抗-EpCAM的大多数癌症样本，抗PSMA的前列腺癌样本）在PBS准备的解决方案。吸引到了微管的E-选择素和抗体溶液50μL，并允许在室温下为2小时孵化。 非特异性细胞粘附与5％的牛奶蛋白被封锁。准备一个5％（W / V）牛奶蛋白在PBS的解决方案。微管吸引到50μL牛奶蛋白解决方案，并允许在室温下为1小时孵化。 绘制成管50μL的PBS及在室温下离开，直到血或白膜样品准备处理。 10分钟前使用隔离的微管，吸取50微升PBS已经饱和，以激活选择的分子与Ca 2 +（PBS +“）。 4。样品制备，细胞分离绘制或索取10毫升的血液，从病人到肝素管。 地方10毫升到50 mL离心管Ficoll分离 – Paque淋巴细胞分离的解决方案。轻轻层Ficoll分离顶部10毫升全血，以免混合血液和Ficoll。 2000XĞ离心15分钟在4°C间最小减速。 除去白膜层和地点在新的管。 用PBS洗白膜（230XĞ离心10分钟，弃上清）。 1毫升红细胞裂解液轻轻悬浮细胞孵育10分钟在室温下溶解红细胞。 加入10毫升的PBS，轻轻混匀，离心10分钟230XĞ。弃上清，轻轻悬浮颗粒在3至4毫升PBS +。 5。细胞分离附加功能化微管5毫升注射器，使用艺达思适配器的一端。 插入到注射泵的注射器。 淹没成细胞suspensio的官能微管的开口端N。 通过在1至4 mL / h的微管处理的细胞悬液。 转让的微管的开口端管PBS +和300μL，PBS +到注射器吸取0.016毫升/分钟，从松散的绑定和细胞的微管。 放入一个干净的管的微管的开口端。从微管断开注射器和附加Accutase预填充注射器。轻轻地灌注到微管填补（〜50μL）足够的Accutase和允许在室温下孵育10分钟。 将注射器1毫升培养基（79％，20％胎牛血清的RPMI 1％青霉素链霉素）和微管灌注预先填写，收集到组织文化的污水处理孔板。 培养细胞在37℃，湿条件下CO 2 5％。 6。代表结果这项技术的目标是可行的癌细胞，癌症患者的血液从隔离。几种方法存在的文化，以确定癌细胞的设备成功的必要的核查。我们选择了除了到DAPI染色与针对上皮基，如EpCAM的上皮细胞粘附分子（）或PSMA的前列腺特异性膜抗原（）的抗体细胞培养，以确定完整的细胞核（图2和3）。夺取癌细胞的数量，使用这种技术必然是一个CTCs的数量开始样品中的功能，病人可变性高。在处理IV期癌症患者确诊样本中，我们经常捕获100和500之间每管血癌细胞，纯度> 50％。紧随隔离，污染白细胞更大的可能是存在的。然而，这些数字将被耗尽以下潜伏期长达5天，在培养基。 <st荣>图1示意图反恐显示选择素介导的滚动抗体介导的静态粘附的隔离，微管的功能。 图2。反恐隔离的代表从乳腺癌患者和肺癌患者的血液样本得出的数据。验明正身CTC EpCAM的染色的活细胞的数量是由坚实的酒吧和涉及到的左坐标和鉴定细胞的百分比表示，作为反恐相比，捕获的细胞总数的代表是由开放的酒吧和测量正确的坐标。结果培养5天。 从单独的捐助者（A和B）在文化CTC随后的5天到isolati代表显微图3。从一个癌症病人​​的血液样本。细胞荧光染色与AlexaFluor 488（绿色）和4',6-diamidino-2-苯基吲哚（DAPI）的可视化的核（蓝色）EpCAM的。