JoVE Journal > Immunology and Infection
Summary
Abstract
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
免疫与感染

ניתוח ספקטרומטריה של אנטיגנים Glycosphingolipid

Published: April 16, 2013
doi:
10.3791/4224
, ,
1Undergraduate Program,Rice University , 2Proteomics Facility, Department of Pathology,University of Texas MD Anderson Cancer Center , 3Department of Melanoma Medical Oncology,University of Texas MD Anderson Cancer Center , 4University of Texas Graduate School of Biological Sciences at Houston

Summary

שיטה ספציפית ורגישה לגיבוש תובנה לפרופיל הביטוי של אנטיגנים glycosphingolipid באיברים ותאי חיסון מתוארת. השיטה מנצלת את ספקטרומטריית מסות מלכודת היונים המאפשר פיצול צעד חכם של מולקולות glycosphingolipid לניתוח מבני בהשוואה לסטנדרטים מסונתזים כימי.

Abstract

Glycosphingolipids (GSL של) שייך למעמד של glycoconjugate Biomacromolecules, הנושא מידע מבני לתהליכים ביולוגיים משמעותיים כגון התפתחות עוברית, העברת אותות, והכרת קולט חיסונית 1-2. הם מכילים סוכר moieties המורכב בצורת איזומרים, וmoieties שומנים עם וריאציות כולל אורך שומן acyl שרשרת, unsaturation, וhydroxylation. שני מנות פחמימות וceramide עשויות להיות בסיס למשמעות ביולוגית. לדוגמה,-hexosylceramides תלת כולל globotriaosylceramide (Galα4Galβ4Glcβ1Cer) וisoglobotriaosylceramide (Galα3Galβ4Glcβ1Cer), שבו יש המונים מולקולריים זהים אך זיקות שונות של סוכר מחצית פחמימות, אחראית לתפקודים ביולוגיים שונים לחלוטין 3-4. בדוגמה אחרת, זה כבר הוכיח כי שינוי של חלק ceramide של אלפא galactosylceramide, יגנד אגוניסט חזק עבור invariתאי נמלה NKT, שינויי הפרופילים שלהם ציטוקינים ההפרשה והתפקוד במודלים של בעלי חיים של הסרטן ומחל אוטואימוניות 5. הקושי בביצוע ניתוח מבני של איזומרים באיברים חיסוניים ותאים לשמש מכשול לקביעה רבים תפקודים ביולוגיים 6.

כאן, אנו מציגים גרסה דמיין של שיטה לניתוח פשוט יחסית, מהיר, ורגיש של פרופילי glycosphingolipid בתאי מערכת חיסוניים 7-9. שיטה זו מבוססת על שינוי כימי וחילוץ (permethylation, ראה להלן האיור 5A, כל קבוצות OH של hexose הוחלפו MEO לאחר תגובת permethylation) של glycosphingolipids 10-15, ואחרי ניתוח שלאחר מכן באמצעות ליזר המטריצה ​​בסיוע desorption / יינון זמן של טיסת ספקטרומטריית מסה (MALDI-TOF/MS) וספקטרומטריית מסות מלכודת יונים. שיטה זו דורשת 50,000,000 תאים חיסוניים לניתוח מלא. הניסויים יכולים להסתיים בתוך שבוע. השפע היחסי של glycosphingolipids השונה יכול להיות שמסומן בהשוואה לסטנדרטים סינטטיים. לשיטה זו רגישות של מדידת 1% iGb3 בין Gb3 איזומרים, כאשר 2 fmol של iGb3/Gb3 תערובת כוללת היא הווה 9.

ספקטרומטריית מסות מלכודת יונים יכולה לשמש כדי לנתח איזומרים. לדוגמה, כדי לנתח את הנוכחות של globotriaosylceramide וisoglobtriaosylceramide באותו המדגם, אפשר להשתמש בפיצול של מולקולות glycosphingolipid מבני להבחין בין השניים (ראה להלן איור 5). יתר על כן, שינוי הכימי של moieties הסוכר (באמצעות תגובת permethylation) משפר את היינון ויעילות פיצול לרגישות וסגולית גבוהות יותר, ומגדיל את היציבות של שאריות sialic חומצה. שינוי החילוץ והכימי של glycosphingolipids יכול להתבצע בברדס כימי מוסמך קלסי, וספקטרומטריית המסה יכולה להתבצע על ידי ליבהמתקנים עם מכשירי מלכודת יוני טרשת נפוצה.

Protocol

1. חששות בטיחות מעבדה כל הממסים האורגניים חייבים להיות מאוחסנים באזורים ספציפיים עם תיוג ברור. ראה תוויות ידי מייצר עבור סוגים של מטפי כיבוי אש הנדרשות. כמה ריאגנטים משמשים הם פוטנציאל מסרטנים, ועלולים לגרום לדיכאון נפשי. ריאגנטים אלה יש לטפל במכסת מנוע כימי עם אוורור (ראה טבלה של חומרים כימיים וציוד לפרטים ספציפיים). מומלץ כי בעת עבודה עם ממסים אורגניים ותאים, ציוד מגן אישי כגון כפפות, מעייל מעבדה, והגנת עין להיות מנוצלות בכל העת. 2. הפקת Glycosphingolipids מתאי הלוקמיה Rat תאי חנות RBL חולדת וקמיה 8 (10000000-100000000) ב16×100 צינורות זכוכית מ"מ מתחת -80 ° C תנאים. תאים נספרים על ידי hemocytometer לאחר הצביעה הכחולה trypan. כדאיות של תאים צריכה להיות גבוהה יותר מ 95%. חלץ את השומנים באמצעות sonicat הנרחביון ארבעה פעמים במשך 1-2 שעות כל אחד עם ממסים קוטביים מעורבים. השתמש 6 מ"ל של כלורופורם מתנול 1:1 (v / v) הראשון ואחרון הממס. שישה מ"ל של isopropanol: הקסאן: H 2 O 55:25:20 (v / v / v, להסיר שלב העליון על ידי שאיפה לפני שימוש) ואז ניתן להשתמש כשני ושלישי ממס. ממס זה נערך על ידי ערבוב isopropanol: הקסאן: H 2 O ב55:25:20 יחס, טלטל אותו נמרצות, ומאפשר לשלב עליון להופיע, שיש להסירו. שמור על השלב הנמוך יותר לשימוש. עקוב sonication עם צנטריפוגה לגלולת החומר המסיס. ברכת supernatants. ייבש אותם בSpeedvac עבור 4 שעות. זרם חנקן או מאייד סיבובי יכול לשמש אם Speedvac אינו זמין. השתמש במלכודת קרה טובה להחזיק ממסים אורגניים התאדו. זיהום של ממס אורגני לשמן משאבת ואקום לבזות את היעילות של משאבת הוואקום. בצע ניתוח ראשוני באמצעות ביצועים גבוהה כרומטוגרפיה שכבה דקה (HPTLC). כדי לכמת גליקוליפידים, להכין 0.2% Orcinol ב50% פתרון חומצה גופרתי (100 מ"ג ב50 מ"ל) וגלקטוז תקן (40 מ"ג בפתרון מניית מ"ל 100). הכן בנפח תגובה 30 μl סדרה של דילולים שישמש כעקומה סטנדרטית (בין 0 ג'/ ליטר עד 20 גר '/ ל'). הוסף 20 μl של מתנול לכל דגימת סדרת דילול. ממס כל דגימת glycolipid ב200 μl של מתנול, sonicate, ולהשתמש 20 μl למדידת כמות glycolipid. ב1.5 צינורות מ"ל Eppendorf עם כובעים מוברגים (Sarstedt, 72.692.005), להוסיף 0.4 מ"ל של 0.2% Orcinol בפתרון חומצה גופרתי 50% לכל מדגם, עם סדרה של גלקטוז-H 2 O-מתנול פתרונות המשמשים לעקומה סטנדרטית . מרתיח במשך 5 דקות בבלוק חימום ב 100 ° C. קריאת צפיפות אופטית של צבע בתגובת 440 ננומטר באמצעות זריחת טקאן Microplate Reader. כדי לבצע HPTLC, השתמש בכלורופורם: מתנול: H 2 O 60:35:8 (v / v / v) ממס עבור שומנים הניטראליים טופלו 01:01 כלורופורם מתנול (V / V). השתמש isopropanol: הקסאן: H 2 O 55:25:20 (v / v / v)הממס עבור שומנים (חומצת gangliosides). את GSLs הניטראלי המבודד הומס בכלורופורם 200 μl ממס: מתנול 1:1 (v / v) והעמיס על צלחת מרק סיליקה ג'ל דקה שכבת כרומטוגרפיה ידי Microcaps דראמונד. הצלחות היו לרוץ בכלורופורם ממס: מתנול: H 2 O 60:35:8 (v / v / v) ומיובש. את glycosphingolipids היו דמיין ידי חומצה גופרתית Orcinol-ב 300 ° C. על מנת להפריד את השומנים הניטראליים מהשומנים חומציים, שהבר החוצה את השומנים הניטראליים וחומצי על ידי כרומטוגרפיה חילופי אניון על עמודה קטנה של DEAE Sephadex-25 [שרף A25 DEAE Sephadex יכול להיות מוכן על ידי שריית שרף Sephadex-25 אבקה בכלורופורם: מתנול: H 2 O 30:60:8 (v / v / v) למשך הלילה. לשאוב supernatant עד שרף A25 Sephadex הוא כל מה שנשאר. הוסף כלורופורם טרי: מתנול: H 2 O 30:60:8 (v / v / v) כדי לשטוף את השרף. חזור שלוש פעמים כדי להסיר את השאריות הטעונות שלילי מ] שרף Sephadex A25. להמס, Sonicate (לא יותר מ 10 דקות), וresuspend את השומנים מצעד 2.1 בכלורופורם: מתנול: H 2 O 30:60:8 (v / v / v) בעת הצורך. הכן את עמודת DEAE Sephadex קטן A25 (טופס Cl) באמצעות צמר זכוכית ו9 "פסטר פיפטה. ארוז את צמר הזכוכית בזהירות, כדי שאבקת השרף אינה עוברת דרך העמודה. הוסף DEAE Sephadex A25 (טופס Cl) לשרף" צוואר "של 9" פיפטה פסטר בלי לתת הטור יבש. ודא שאתה לא רואה שום שרף בeluent. הדגימות מומסות בכלורופורם: מתנול: H 2 O 30:60:8 (v / v / v) היו מומסות. שבריר השומנים הניטראלי הוא לזרום דרך שברים. Elute שבריר שומני חומצי (קשור לרפים) עם 8 מ"ל של נתרן יצטט במתנול. ייבש את שני שברים הניטראליים וחומצי, desalt על ידי דיאליזה, לייבש אותם על ידי Speedvac ולנתח אותם על ידי HPTLC. שבריר חומצי מכיל gangliosides, אשר ניתן לדיאליזת 3 תגובת השלב ישירות.השבריר הניטראלי מכיל לא רק glycosphingolipids הניטראלי, אלא גם פוספוליפידים (phosphatidylcholine וsphingomyelin), שיש להסיר על ידי תגובת acetylation. מניסיוננו, השיטה של ​​קלטת דיאליזה, היא יעילה יותר ונוחה יותר מאשר צינור דיאליזה או כרומטוגרפיה עמודת C18 שלב הפוך. השלב הבא הוא הסרת פוספוליפידים מglycosphingolipids הניטראלי ידי acetylation ותגובת peracetylation. ייבש את DEAE Sephadex-25 תמסורת בשבריר Speedvac (עם קירור) עבור 4 שעות. לאחר שהדגימות הן יבשות, החזרת אותם לSpeedvac ויבש במשך 4 שעות נוספות. ודא שהדגימות הללו הן יבשות לחלוטין, כפי שכל מים שיורית ימנעו תגובת peracetylation. Peracetylate את הדגימות עם 1 מ"ל של פירידין ו0.5 מ"ל של אנהידריד אצטית בחושך בטמפרטורת חדר או 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה. סכום זה של אנהידריד פירידין ואצטית הוא נכון לתקופה של עדעד 200 מיקרוגרם של glycosphingolipids. תגובה זו יכולה להתבצע על 37 מעלות צלזיוס, כפי שGSLs יש מסיסות טובה יותר. ייבש את חומר peracetylated ידי Speedvac ל3 שעות, עם תוספת של 1 מ"ל של טולואן 3x (coevaporation) כדי להבטיח אידוי מלא. אם הדגימות עדיין לא יבשות לחלוטין, Speedvac עד יבש. הכן את עמודת Florisil (סיגמא אולדריץ) (30-60 רשת, 10 × 80 מ"מ) בפיפטה פסטרה עם צמר זכוכית, שימוש בחרוזי Florisil. חרוזי Florisil צריכים להיות יבשים לחלוטין לפני השימוש, על ידי דגירה ב° C 110 תנור. מלא את החרוזים לתוך פיפטה פסטר עד הצוואר, ולאזן ב1,2-dichloroethane-הקסאן 04:01 (V / V). Elution מעמודת Florisil הוא מהיר מאוד. תנודתיות מהירה של הממסים יכולה להוביל לייבוש עמודות. לכן כל תערובות הממסים צריכות להיות מוכנות לפני הפעלת העמודה מאז לא ניתן לעצור את הטור במהלך elution. החל peracetylמדגם ated ב1 מ"ל של 1,2-dichloroethane-הקסאן 04:01 (V / V), ולשטוף את העמודה עם 6 מ"ל של אותו הממס, ואחרי 10 מ"ל של 1,2-dichloroethane. Elute GSLs peracetylated ניטראלי עם 6 מ"ל של 1:1 1,2-dichloroethane-אצטון (V / V). צעד זה מסיר את פוספוליפידים peracetylated מglycosphingolipids, כי glycosphingolipids peracetylated להיקשר לעמודת Florisil, בעוד פוספוליפידים peracetylated לא. ייבש את השברים על ידי Speedvac ל2 שעות וdeacetylate עם methoxide 2 המ"ל 0.5 מ 'נתרן [סיגמה אולדריץ, 403067] ב2 מ"ל של מתנול ל3 שעות בטמפרטורת חדר. לנטרל את התערובת עם 3 מ"ל של חומצה אצטית methanolic [אצטית חומצה / מתנול 15/85 v / v], יבש על ידי Speedvac, desalt ידי דיאליזה [ממס את המוצרים היבשים ב3 מ"ל של מים, ולהזריק לתוך Slide-A-Lyzer קלטת דיאליזה, דיאליזה נגד מים למשך 24 שעות. להחליף את המים לפחות פעמים]. ייבש את GSLs הדיאליזה (בתמיסת מים) על ידי Speedvac עד הדגימות יבשות לחלוטין. </li> 3. שינוי כימי (Permethylation) של Glycosphingolipids 13 להציג GSLs (1-20 ק"ג) לשפופרת זכוכית עם מכסה מתברג ואוניית טפלון, ולהוסיף sulfoxide דימתיל (150 μl) ללא שימוש בתנאים מיוחדים ייבוש או אווירת הגז אינרטי. הכן נתרן הידרוקסידי אבקה (40-60 מ"ג) מחלקיקי נתרן הידרוקסידי על ידי הטחינה שלהם במכתש כימי עם עלי. הקפד לאחסן את האבקות בסביבה יבשה מאוד והקפיד לעשות טחינה במכסת המנוע הכימי כדי למנוע נושם את האבקות. הבא מוסיף את אבקת נתרן הידרוקסידי לפתרון המדגם במרית. הוסף iodomethane (80 μl) עם 100 microliter Halmilton מזרק, [או VWR microliter 100 המכוילים פיפטה הקשורה למזרק דרך צינור גומי ניתן להשתמש], ולנער את התערובת בטמפרטורת חדר למשך השעה 1. להרוות את תגובת מתילציה במים (2 מ"ל). חלץ את מוצרי permethylated 3 פעמים על ידיהתוספת של dichloromethane (2 מ"ל) [גליקוליפידים נמצאות בשלב dichloromethane, המהווה את השלב הנמוך יותר, כך השלב העליון יכול להיות מועבר לשפופרת זכוכית חדשה, והוציא שוב עם dichloromethane]. שטוף dichloromethane משולב תמציות 3 פעמים עם 2 מיליליטר מים [שלב העליון, שאינו המים, ואז יכולה להיות מסולק]. לאחר השטיפה הסופית, להעביר את הדגימות לצינור חדש, ומייבשים בSpeedvac. דוגמאות אז ניתן להמס ב100-200 μl של מתנול לניתוח ESI-MS. 4. ניתוח MALDI-TOF של Gycosphingolipids Permethylated לבצע ניסויי MALDI-TOF-MS וMALDI-TOF/TOF-MS/MS על MALDI TOF-TOF המוני ספקטרומטר (Applied Biosystems 4700, הפוסטר סיטי, קליפורניה). הכן את המטריצה ​​על ידי ערבוב נפח 50% של 10 מ"ג / מיליליטר dihydroxybenzoic חומצה (DHB) באצטוניטריל ו50% נפח של חומצת trifluoroacetic 0.1% (TFA) במים. מטריצת DHB ניתן הבחינה בMALDI target (μl 1), ואחריו μl 1 (המכיל 100 GSLs ng) מקום של מדגם מומס במתנול. החל לאט ולהניח לו להתייבש לפני הניתוח. 5. ניתוח MS מלכודת יונים של Glycosphingolipids Permethylated לבצע ספקטרומטריית מסות על ספקטרומטר יניארי מלכודת יונים המוני (LTQ, ThermoScientific, סן חוזה, קליפורניה) באמצעות מקור nanoelectrospray, שיעור 0.30 μl / דקת זרימה ב230 ° C טמפרטורת נימים במצב יון חיובי עם 30-50% אנרגית התנגשות. הגדר אנרגיות התנגשות לעזוב שפע השיורי מינימאלי של יון מבשר. לזהות את כל היונים כadducts נתרן. זהה את iGb3 (Galα3Galβ4Glcβ1Cer) בתערובת של isobaric Gb3 (Galα4Galβ4Glcβ1Cer) וסטנדרטי iGb3 (Galα3Galβ4Glcβ1Cer) על ידי השוואה בין הדפוסים השונים של 4 יוני מוצר MS מהיון המולקולרי sodiated באמצעות בר glycan מ '/ z 667 וdisaccharide המסוף 1 – ene יון מ '/ z 445 (כלומרX → 667 → 445 →, X פירוש היון המולקולרי זוהה בשעת 1 MS) של תקני iGb3 permethylated טהורים (Galα3Galβ4Glcβ1Cer) באמצעות ESI-LIT-MS עם אלה של permethylated Gb3 (Galα3Galβ4Glcβ1Cer).

Representative Results

דוגמה לניתוח MALDI MS של glycosphingolipids מRBL חולדת וקמיה של תאי קו (סוג תא מציגי אנטיגן שמציג אנטיגנים glycosphingolipid לתאי NKT) מוצגת באיור 3. היונים ניתן להקצות מבני glycosphingolipid ספציפיים (איור 3 א). בתאים שטופלו על ידי 16 RBL NB-DGJ, תרופה המעכבת את סינתזת glycosphingolipid, הפחתה משמעותית של כל glycosphingolipids נצפתה (איור 3 ב '). איזומרים מבניים לא ניתן להבדיל. קיבולת MS / MS של אפלייד Biosystems 4700 מאפשרת פיצול של MS1 יונים עד 2 שברים בטרשת נפוצה, המאפשרת מידע מבני מוגבל להיות שנוצר. עם זאת, ניתוח MS2 הוא לעתים קרובות לא מספיק כדי להפלות איזומרים oligosaccharide. הניתוח של glycosphingolipids MS יון-המלכודת מאפשר מחקר של איזומרים, כגון iGb3 (Galα3Galβ4Glcβ1Cer) וGb3 (Galα4Galβ4Glcβ1Cer) אשר עשוי להתקיים כיוני trihexosylceramide אותרו באיור 3 א. כדי לזהות איזומרים כאלה, הסטנדרטיים iGb3 וGb3 נותחו על ידי סבבים רבים של פיצול, עד נמצאו הבדלים (איור 4 א ו -4 ב). בדוגמא המובאת כאן (איור 5 ג) יכולים להיות מופלה iGb3 וGb3 על ​​ידי השוואה לסטנדרטי iGb3 וGb3. איור 1. תרשים זרימה של הליך שאיבת glycosphingolipid, ושינוי הכימי של glycosphingolipids (permethylation). Glycosphingolipids הוצאו מתאים בממסים אורגניים. כדי להסיר-glycosphingolipids עישון, שומנים יכולים להיות peracetylated וdeacetylated. שנית, glycosphingolipids היה שינוי כימי על ידי תגובת permethylation, אשר משפר את הרגישות וסגולית של MS detection. לבסוף, את פרופילי glycosphingolipid נקבעו באמצעות MALDI-TOF ספקטרומטריית מסה וספקטרומטריית מסות מלכודת יונים. איור 2. כימות Glycosphingolipid ידי שיטת חומצה גופרתית Orcinol: כימות של glycosphingolipids באמצעות 0.2% Orcinol בתמיסת 50% חומצה גופרתית ועקומת סטנדרט גלוקוז. איור 3. Glycosphingolipidomics של תאי סרטן דם חולדת ספקטרום א נציג MALDI המוני; כל יון. מייצג מבנה glycosphingolipid ספציפי, איזומרים מבניים לא ניתן להבדיל ב NB-DGJ, תרופה שמעכבת את סינתזת glycosphingolipid, הים.ignificantly מפחית את כל glycosphingolipids מיוצר בתאי RBL. איור 4. ספקטרומטריית טנדם המוני של איזומרים של Glycosphingolipids. מסלולי א אופייניים לפירוק ספקטרומטריית חיובית מצב מלכודת יונים המוניים של GSLs permethylated Gb 3 CER ו 3 CER IGB. 3 GB וIGB 3, בוודאי מופרדים על ידי דפוסי פיצולם. ההבדלים בהצמדה משתקפים ב4 יוני מוצר MS העקביים עם 445 מ 'מבשרי isobaric / z. ב'. נציג תוצאות מראות iGB3 ניתן למדוד בתערובת של איזומרים iGb3/Gb3. כוכבים מצביעים על יונים לאבחון iGb3 בלבד. לחצו כאן כדילהציג דמות גדולה. איור 5. מלכודת היונים MS מאפשר ניתוח של איזומרים של glycosphingolipids. א התקן iGb3 והבדל תכנית Gb3 של פרופיל פיצול לאחר 4 סבבים של פיצול בספקטרומטר מסת מלכודת LTQ יון. 4 פרופיל MS B. האופייני של יונים הנגזרים מiGb3 או Gb3. ג Trihexosyleramides הם תערובות של iGb3 וGb3 איזומרים שניתן לזהותם על ידי מלכודת יוני MS שיטה (איור ידי Dapeng ג'ואו). לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.

Discussion

Glycome, מונח שטבע באנלוגיה לגנום וProteome, מתייחס לכל מבני saccharide של האורגניזם. כדי להבין את פונקציות הסעפת של glycosylation מלא ידרוש גישה משולבת הכולל שני מחקרי glycomics התפקודיים ומבניים. שניהם מסובכים ידי הטבע מונע אינו התבנית של ביוסינתזה glycan, מורכבות וגיוון התוצאה של מבני glycan, מעורבות התכופה של מבנה aglycone באינטראקציות glycan ויסות יגנד לרצפטור ברמה המולקולרית, ואת החשיבות הפונקציונלית של ligands שפע הנמוך.

הדעה מקובלת היא, שספקטרומטריית המסה (MS) היא שיטה חיונית ללימודי glycomics מבניים, במיוחד לזיהוי ואפיון ligands שפע נמוך. כדי לצפות glycans או glycoconjugates כמינים מולקולריים, לעתים קרובות אנו משתמשים בשיטה יעילה ביותר, נמוכה אנרגית יינון, הנקראת יינון electrospray (ESI). לdet יותר מציק אפיון מבנה glycan, זה חיוני כדי לבחור מינים מולקולריים בודדים ולשבור את glycans לחתיכות קטנות יותר. זה נעשה בדרך כלל על ידי התנגשות מושרה דיסוציאציה, הכולל הפעלה של glycans באמצעות התנגשות עם מולקולות גז אינרטי. האנרגיה המוגברת גורמת לשבירת קשר, וניתוח שיטתי של הברים כתוצאה מספק מידע על המבנה המולקולרי של glycan. לעתים קרובות, שברים "חתימה" יכולים להיות שנוצרו הם שאבחון של תכונות מבניות glycan מסוימות. יחד עם המסה המולקולרית, שברים אלו יכולים לפעמים להיות מספיק לזיהוי glycans, אבל בעבר הרבה יותר מידע כבר נדרש לאפיין אותם באופן מלא, במיוחד אם המבנה הוא רומן. שיטות אלה כוללות ניתוח סוכר קומפוזיציה, ניתוח גז כרומטוגרפיה ספקטרומטריית מסה של acetates alditol מפוגל באופן חלקי לניתוח הצמדה, ועיכול glycosidase ספציפי 17.

<p class="Jove_content"> כפי שהודגם בעשור האחרון 18-19, סבבים רבים של פיצול אנרגיה נמוך, שיכול להתבצע ביעילות בספקטרומטר מסת יון מלכודת (IT-MS), משפר באופן משמעותי את תשואת המידע מניתוח ספקטרלי המוני glycan . עם ארבעה או חמישה סיבובים של פיצול (שלא ניתן לעשות עם מכשירי טרשת נפוצה אחרים), ניתן להבחין glycans isomeric המכילים את רכיבי סוכר אותן מסודרות בקשרי סוכר שונים, גם כאשר אלה נמצאים יחד בתערובות של מרכיבים באותה מסה מולקולרית (isobars). בניתוח זה, את glycans היה derivatized, החלפה כל קבוצות הידרוקסיל חינם עם קבוצות מתיל באמצעות permethylation. בעוד המשימה מבנית של glycans אפשרית ללא permethylation, permethylation מגביר את רגישות 17.

Levery וג'ואו, שלבו את כל היתרונות האפשריים של המתודולוגיה IT-MS, כולל זיהוי של isomeric structures באמצעות יוני חתימת אבחון המצויים רק בטרשת נפוצה 4 ו 5 ספקטרום MS, לזיהוי וללכמת הרגיש מאוד של glycosphingolipids הווה בצורה של תערובות מרובות isobaric 7-9. בתאוריה, ייתכן שנוכל לזהות כל מבנה glycolipid קיים, עד לזמינות של גליקוליפידים סטנדרטיים, אשר יכול להיות מסונתז כימי.

השלבים הקריטיים של ניתוח זה הם קצב ההחלמה של GSLs מדגימות ביולוגיות. בדרך כלל 80 מיקרוגרם של GSL ניתן לשחזר מ 100 מיליון תאים סרטניים כגון RBL. כדי להפיק יונים מולקולריים מספיקים לסבבים רבים של פיצול בספקטרומטרים המוניים יון מלכודת, לפחות 10 מיקרוגרם של GSLs הסרטני נדרשים. תשואה נמוכה של GSLs במהלך הטיהור תביא לשפע נמוך של יונים, שלא יכול להיות נתון לפיצול נוסף. ההצלחה של ניתוח תלויה בכמות GSLs אשר התאושש. בדרך כלל, conc הסופיentration של GSLs permethylated צריך להגיע 1 מ"ג / מ"ל, מומס במתנול, לפני שנתח במקור ננו electrospray. המגבלה לניתוח מעמיק MS n היא תלויה בשפע של יון ספציפי בפרופיל 1 טרשת נפוצה. דואר שפע יון טיפוסי 7 נדרש לניתוח 5 MS יסודי. התשואה הנמוכה של GSLs במהלך הטיהור יכולה להיגרם על ידי אובדן GSLs במהלך שלב peracetylation (אשר מסיר את פוספוליפידים), כאשר לכל GSLs acetylated חייב להיות מחויב לעמודת כרומטוגרפיה שרף Florisil, התרחץ, ולאחר מכן eluted. כדי להבטיח את הכריכה של GSLs לפי acetylated לג'ל סיליקה, דגימות יש מחסנית פעמים לעמודת כרומטוגרפיה לאחר זורם.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

DZ נתמך על ידי מרכז סרטן MD Anderson וNIH AI079232 מענקים. מרכז סרטן MD Anderson נתמך בחלקו על ידי מענק NIH CA16672.

Materials

Name of the reagent Company Catalogue number Comments (optional)
1,2 Dichloroethane Sigma-Aldrich 34872 Carcinogenic
Acetic acid VMR JT9524-0
Acetic anhydride Fluka 45830
Acetone Fischer A18P-4
Chloroform Fischer C606-1 Carcinogenic
DEAE Sephadex A25 (Cl Form) GE Healthcare Biosciences AB 17—170-01 100 gram
Decane (anhydrous): Sigma-Aldrich 457116 100 ml
Dichloroacetic acid Sigma D54702 Carcinogenic
Dialysis cassette Fischer(Pierce) 66110 Slide-A-Lyzer, 3500 MWCO, 3-12 ml
DMSO Thermo Scientific 20684
Ethyl acetate Fischer UN1173
Florisil Fluka 46384 for packing chromatography column
Hexanes EMD HX0290-6
Iodomethane Riedel de Haen, Germany 03810 stabilized with silver foil Carcinogenic
Methanol VWR/EMD MXO475-1
Neutral glycosphingolipid Qualmix Matreya 1505
Monosialganglioside mixture Matreya 1508
Disialoganglioside mixture Matreya 1509
Lactosyl ceramide and sialosylderivatives Matreya 1510
Gangliotetraosyl ceramide and sialosyl derivatives Matreya 1511
Pasteur pipettes Fischer 13-678-6A 9″”
Pyridine: Sigma 270407
Sodium Hydroxide: BDH 0292 500 gram
Sodium methoxide Sigma 404367 0.5 M solution in methanol
Toluene J.T. Baker 9351-03 4 L
Name of the equipment Company Catalogue number Comments (optional)
Pasteur pipettes Fischer 13-678-6A 9″”
Fiber glass (glass wool) Corning Incorporated 3950 Pyrex 9989 glass
12×75 mm glass tubes Fischer 14-962-10B
Calibrated pipettes (100 microlitter) VMR 53432-921
16×100 mm disposible borosilicate tubes x1,000 Fischer 14-961-29 With screw caps
Caps for glass tubes Kimble 40566C size/13-415
Merck TLC plates Sigma Z 29, 301-6
Glass tank for TLC Sigma Z 12,619-5
Drummond Microcaps Drummond scientific company 1-000-0100 10 μl, for loading of TLC samples
Sunrise Microplate Absorbance Reader Tecan A-5082
Whatman Chromatography Paper Fischer 05-716-3E 18 cm x 34 cm For TLC Tank
Orcinol ferric chloride spray reagent Sigma O7875 For detecting glycosphingolipids on TLC plates
Prevel Spray Unit Sigma Z 36,555-6
Sonicator Fischer FS20
Centrifuge Sorvall Legend RT
Speedvac Savant AS160 With chemical trap for organic solvants
MALDI TOF-TOF Mass spectrometer Applied Biosystems Proteomics 4700
Ion Trap Mass spectrometer Thermo LTQ
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Schnaar, R. L., Suzuki, A., Stanley, P., Varki, A., Cummings, R. D., Esko, J. D., Freeze, H. H., Stanley, P., Bertozzi, C. R., Hart, G. W., Etzler, M. E. Chapter 10 Glycosphingolipids. Essentials of Glycobiology. , (2009).
  2. Bendelac, A., Paul, W. E. Chapter 17 NKT cells and other Innate-like T and B lineages. Fundamental Immunology. , (2011).
  3. Jacewicz, M., Clausen, H., Nudelman, E., Donohue-Rolfe, A., Keusch, G. T. Pathogenesis of shigella diarrhea. XI. Isolation of a shigella toxin-binding glycolipid from rabbit jejunum and HeLa cells and its identification as globotriaosylceramide. J. Exp. Med. 163 (6), 1391-1404 (1986).
  4. Zhou, D. The immunological function of iGb3. Curr. Protein Pept. Sci. 7 (4), 325-333 (2006).
  5. Miyamoto, K., Miyake, S., Yamamura, T. A synthetic glycolipid prevents autoimmune encephalomyelitis by inducing TH2 bias of natural killer T cells. Nature. 413 (6855), 531-534 (2001).
  6. Zhou, D., Levery, S. B., Hsu, F. F., Wang, P. G., Teneberg, S., Almeida, I. C., Li, Y., Xu, H., Wang, L. X., Xia, C., Ibrahim, N. K., Michael, K. Immunologic mapping of glycomes: implications for cancer diagnosis and therapy. Frontiers in Bioscience. S3, 1520-1532 (2011).
  7. Li, Y., Thapa, P., Hawke, D., Kondo, Y., Furukawa, K., Furukawa, K., Hsu, F. F., Adlercreutz, D., Weadge, J., Palcic, M. M., Wang, P. G., Levery, S. B., Zhou, D. Immunologic glycosphingolipidomics and NKT cell development in mouse thymus. J. Proteome Res. 8 (6), 2740-2751 (2009).
  8. Li, Y., Zhou, D., Xia, C., Wang, P. G., Levery, S. B. Sensitive quantitation of isoglobotriaosylceramide in the presence of isobaric components using electrospray ionization-ion trap mass spectrometry. Glycobiology. 18 (2), 166-176 (2008).
  9. Li, Y., Teneberg, S., Thapa, P., Bendelac, A., Levery, S. B., Zhou, D. Sensitive detection of isoglobo and globo series tetraglycosylceramides in human thymus by ion trap mass spectrometry. Glycobiology. 18 (2), 158-165 (2008).
  10. Hakomori, S. I. A rapid permethylation of glycolipid, and polysaccharide catalyzed by methylsulfonyl carbanion in dimethyl sulfoxide. J. Biochem. (Tokyo). 55, 205 (1964).
  11. Ciucanu, I., Kerek, F. Rapid and simultaneous methylation of fatty and hydroxy fatty acids for gas-liquid chromatographic analysis. Carbohydr. Res. 131, 209 (1984).
  12. Kang, P., Mechref, Y., Klouckova, I., Novotny, M. V. . Rapid Commun Mass Spectrom. 19 (23), 3421-3428 (2005).
  13. Levery, S. B., Hakomori, S. Microscale methylation analysis of glycolipids using capillary gas chromatography-chemical ionization mass fragmentography with selected ion monitoring. Methods Enzymol. 138, 13-25 (1987).
  14. Spooncer, E., Fukuda, M., Klock, J. C., Oates, J. E., Dell, A. Isolation and characterization of polyfucosylated lactosaminoglycan from human granulocytes. J. Biol. Chem. 259 (8), 4792-4801 (1984).
  15. Ciucanu, I., Costello, C. E. Elimination of oxidative degradation during the per-O-methylation of carbohydrates. J. Am. Chem. Soc. 125, 16213 (2003).
  16. Platt, F. M., Neises, G. R., Karlsson, G. B., Dwek, R. A., Butters, T. D. N-butyldeoxygalactonojirimycin inhibits glycolipid biosynthesis but does not affect N-linked oligosaccharide processing. J. Biol. Chem. 269 (43), 27108-27114 (1994).
  17. Mulloy, B., Hart, G. W., Stanley, P., Varki, A., Cummings, R. D., Esko, J. D., Freeze, H. H., Stanley, P., Bertozzi, C. R., Hart, G. W., Etzler, M. E. Chapter 47 Structural Analysis of Glycans. Essentials of Glycobiology. , (2009).
  18. Ashline, D., Singh, S., Hanneman, A., Reinhold, V. Congruent strategies for carbohydrate sequencing. 1. Mining structural details by MSn. Anal. Chem. 77 (19), 6250-6262 (2005).
  19. Zhang, H., Singh, S., Reinhold, V. N. Congruent strategies for carbohydrate sequencing. 2. FragLib: an MSn spectral library. Anal. Chem. 77 (19), 6263-6270 (2005).

Tags

Mass Spectrometric AnalysisGlycosphingolipid AntigensGSL’sGlycoconjugate BiomacromoleculesStructural InformationEmbryonic DevelopmentSignal TransductionImmune Receptor RecognitionSugar MoietiesIsomersLipid MoietiesFatty Acyl Chain LengthUnsaturationHydroxylationCarbohydrate PortionCeramide PortionTri-hexosylceramidesGlobotriaosylceramide (Galα4Galβ4Glcβ1Cer)Isoglobotriaosylceramide (Galα3Galβ4Glcβ1Cer)Molecular MassesSugar LinkagesBiological FunctionsModification Of Ceramide PartAlpha-galactosylceramideCytokine Secretion ProfilesInvariant NKT CellsCancer ModelsAutoimmune DiseasesStructural Analysis Of IsomersImmune Organs And Cells

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Yin, A. B., Hawke, D., Zhou, D. Mass Spectrometric Analysis of Glycosphingolipid Antigens. J. Vis. Exp. (74), e4224, doi:10.3791/4224 (2013).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image