の細胞特異的な分析<em>シロイヌナズナ</em>蛍光活性化細胞選別を使用した葉

1。プロトプラストの生成かみそりの刃で1ミリメートル幅のストリップ（ 図1）への収穫葉材料とカット。のために最大15葉に単一のリーフ以上を含有するサンプルを簡単にカットする前に積み重ねることができます。 直ちに20mlの溶液 （400mMのマンニトール、20mMのMES水和物は、20mMのKCl、10mMのCaCl 2、2mMのMgCl 2、0.1％BSAおよび2.5mMのβ-メルカプトエタノールを含む9センチメートルラウンドペトリ皿に葉片を転送protoplasting酵素を含むpHは5.7）（1.2％セルロース、R-10、0.6％セルロースRSと0.4パーセントmacerozyme R-10）とRNase及び転写酵素阻害薬（1×ProtectRNAおよび10μg/ mlのアクチノマイシンD）;優しく独立した葉片と真空度は2×5分間浸透させる。 3〜4時間室温およびプロトプラストを90 rpmに設定オービタルシェーカー上にシャーレを置きます。 インキュベーションの間葉片は、使用することによって、互いに分離されるべきである30分ごとの間隔で、フラットピンセットのセットです。 50 mlチューブで70μmのセルストレーナー（フィッシャーサイエンティフィック）を置き、そっとを通じてprotoplastingソリューションをフィルタリングします。これは、プロトプラストが通過できるようにしながらふるいによって保持される葉片を、削除されます。 ゆっくりとフィルター同じ篩4 mlの溶液を用いて葉片を洗浄します。 丸底チューブにプロトプラストを転送し、ペレットプロトプラスト〜5分間300 xgでプロトプラスト溶液を遠心分離します。 穏やかにプロトプラストを乱すことなく、できるだけ多くの上清を可能な限りを吸引。 、遠心分離機で5分間300 xgで5 mlの溶液を用いてプロトプラストを洗浄します。上清を除去パスツールピペットやカットオフP1000チップを使用して、 ソリューションの適切な音量でプロトプラストを懸濁する。 2。葉プロトプラストのFACS </p> すぐにソートする前に、凝集プロトプラストを避けるために（ノンカット）P1000チップを用いてプロトプラストを再懸濁します。 50μmのfilconフィルター（BD Biosciences社）をソートチューブにプロトプラストを転送し、セルソーターのノズルの目詰まりを避けるために、必要に応じて希釈してください。プロトプラスト（これらの設定は、BDの流入セルソーターに最適な20 PSI（シース）と21から21.5 PSI（サンプル）、39.2 kHzの周波数と4000 <事象発生率の圧力で100μmのノズルを使用してソートされます他のセルソーティング·マシン上（BD Biosciences社）。最適化）は、これらの設定を調整する必要があるかもしれません。 GFP陽性プロトプラストを488nmのアルゴンレーザーを使用していて、30分の580バンドパスフィルタ（オレンジ）対40分の530バンドパスフィルター（緑）からの出力をプロットする識別されます。 GFP陽性プロトプラストは、高580 POPUの低530 /ロー580人口と瀕死/デッドプロトプラストと残骸の非GFPのプロトプラストと、高い530/low 580人口になりますlation（ 図2）。 RNAを抽出元となるプロトプラストをソートする場合、プロトプラストを還元剤（ 例えば 、β-メルカプトエタノール）を含む溶解緩衝液の少なくとも4つのボリュームに直接ソートする必要があります。また、単一試料のソート時間は、20〜30分であり、いずれかの時点で処理二から三のサンプルの最大値に制限されるべきである。 ソートされたプロトプラストの可視化のために、プロトプラスト溶液の少なくとも8巻、その後プロトプラストを集中させる遠心分離によって収集に直接ソートする必要があります。 3。代表的な結果このプロトコルは、蛍光活性化細胞選別（ 図1）のために使用されるシロイヌナズナの葉からプロトプラストを得るための方法を説明します。 RNaseおよび転写阻害剤の存在下におけるプロトプラストの生成は細胞fを防ぎromは転写応答をマウントする。これは、自家蛍光の有意水準を持っている多くの死者と瀕死プロトプラストを生じさせるの結果を持っていません。この方法を用いて調製したプロトプラストをソートする場合には、ソートに使用される580nmの対530nmの蛍光のグラフにはいくつかの異なる集団を参照することが非常に一般的です。このプロトコルに使用されるソートゲートと一緒にこのような例は、 図3に示します。 プロトプラスト溶液の8巻にソートされ、濃縮を確認するために可視化のために収集することができます。 図2Gは、これは孔辺細胞にGFPを発現TP382ラインを使用しての例を示しています。 増幅前と後の両方で、この方法を用いて得られた収量の例は、 表1に示されている。算定された金額は、オベーションピコWTAのシステム（500 PG-50 ng）を、したがって、sを用いて増幅するために十分である定量PCR（ 図4）は、次世代シーケンシングやマイクロアレイのいずれかの方法でubsequent分析。 図1実験の全体的なワークフロー。 1）収穫はシロイヌナズナラインをGFP発現から関心のある葉。 2）迅速に約1mm幅のストリップに切断し、直ちにprotoplasting溶液及び真空浸透させるにこれらを転送します。 3）3〜4時間インキュベートする。 4）70μmのふるいを通してゆっくりと濾過プロトプラスト溶液を遠心分離により底チューブ、ペレットプロトプラストを丸める移す。 5）すぐに選別、再懸濁するプロトプラストおよびフィルタは50μmを通じて選別チューブに移す前に。 6）並べGFP陽性およびGFP陰性の実行可能なプロトプラスト。 7）プロトプラストは今どちらか視覚的に分析したり、そのような定量PCR、次世代シーケンシングやマイクロアレイなどの技術を使用して設定できます。 <p class="jove_content" fo:keep-together.withinページ= "always"を> 図2本研究で使用したKC464、KC274とTP382行。向軸表皮にGFPの発現を示すKC464葉のA）の横断面。 B）のプロトプラストはKC464葉由来。血管系にGFPの発現を示すKC274葉のC）の横断面。 D KC274葉由来）プロトプラスト。孔辺細胞におけるGFPの発現を示すE）TP382の葉。 F）のプロトプラストは、TP382の葉に由来する。 TP382葉由来プロトプラストの高い530/low 580集団からプロトプラストを含むGFPを示し、葉の細胞の複雑な背景に孔辺細胞をGFP発現のFACSによって得られた濃縮のG）の例。 AF：共焦点顕微鏡画像、G：蛍光顕微鏡画像。画像内のスケールバーは50μmである。 図3 30分の580 nmの（オレンジ）対40分の530 nm（緑）バンドパスフィルタ（BDの流入のセルソーター）からの出力の典型的なFACS買収ドットプロット。示さソートゲートは通常、ソート時に使用されたものである。単一の低530/low 580人口を示す阻害剤の非存在下でprotoplasted COL-4葉由来プロトプラスト、、のA）ドットプロット。阻害剤によるストレスや着色のために580蛍光のシフトを示す阻害剤の存在下でprotoplasted重量COL-4葉由来プロトプラスト、AからB）ドットプロット。高530/low 580集団で集団を含むGFPを示す阻害剤の存在下でprotoplastedそれぞれKC74、KC464とTP382ライン、、、から葉由来プロトプラストからCE）のドットプロット。 GFP（高530/low 580）集団内のイベントのパーセンテージが与えられている。 拡大図を表示するには、ここをクリックしてください 。 e_content "のfo：キープtogether.withinページ=" always "を> 図4：図3に示すように、代表的なゲーテッド人口画分におけるGFP発現。複製し2つの生物学は、その後行われたGFP特異的プライマー（ 表2）を用いてオベーションピコWTAのシステムと定量PCRを用いて増幅し、各分画の種類が得られた。示された値は、最も高い（赤）、最低（緑）と平均相対値である。高580人口はこのケースでは2、低530/low 580と単一の生物学的replicateは、単一の値のみが表示されているので、使用されていたため高530/low 580に分割されました。 ACT2（At3g18780）は、すべてのサンプルのための標準として用いた。葉：葉全体。未ソート：ソートされていないプロトプラスト。 GFP1：高530/low 580とRest1：低530/low 580、GFP2：高530/high 580とRest2： 図3とインサートで説明したように、低530/high 580、。結果は、検証Oアールソートされた画分（ 例えば、 図2G）におけるGFP細胞含量のf光学評価。 拡大図を表示するには、ここをクリックしてください 。 サンプル 葉数 細胞数 RNAの収量 （NG） RNAの収量 （増幅; NG） 全体の葉全葉B 1 1 – – 8001 10525 4623 *** 4572 *** ソートされていないプロトプラストソートされていないプロトプラストのB 5 5 – – 2433 2625 1152年*** 3321 *** GFP1 Rest1 15 6039（0.39％*） 55389（6.40％*） – ** – ** 861 489 GFP1 B Rest1 B 15 10783（0.63％*） 57040（7.49％*） – ** – ** 537 420 GFP2 Rest2 15 18337（1.49％*） 62405（73.49パーセント*） – ** – ** 360 411 表1サンプルは、FACSを用いて収集し、ライブGFP発現プロトプラストを含有する画分を決定するために、定量PCRで分析した。またオベーションピコWTAシステム（NuGen）で増幅前後NGの総RNAの収量は、この表に含まれています。 GFP1、GFP2、Rest1とRest2画分を、 図4中の挿入で表示されます。総細胞ソート実行の細胞の*割合は分数のセルの数の横に括弧で与えられます。これらのパーセンテージはに相関していない収集レスト細胞のはるかに大きい数のためのGFP画分よりも早く停止したFACSの並べ替えなど、各サンプルのお互いが '休息'分数のために実行されます。製造元のプロトコールに従って増幅反応への入力として使用** 50 NG、。 プライマー シーケンス mGFP5-ER.fw GCCTGAGGGATACGTGCAGGAGA mGFP5-ER.rv TGGCGGGTCTTGAAGTTGGCT ACT2.fw GCCATCCAAGCTGTTCTCTC ACT2.rv GCCATCCAAGCTGTTCTCTC 表2定量PCRプライマー。