细胞特异性分析<em>拟南芥</em>叶用荧光激活细胞分选

1。原生质体生成收获叶材料和切成1毫米宽的条带（ 图1）用剃刀刀片。对于含有较多的比单叶到15叶的样品可以容易地在切割之前层叠。 马上转移叶条到一个9厘米的圆形培养皿中含有20毫升溶液（400mM甘露醇，20mM的MES水合物，20 mM KCl中的10mM的CaCl 2，2毫摩尔MgCl 2，0.1％BSA和2.5mMβ-巯基乙醇， pH 5.7）中，包括原生质体的酶（1.2％纤维素酶R-10，0.6％纤维素RS和0.4％离析酶R-10）和RNase和转录抑制剂（1×ProtectRNA和10微克/毫升放线菌素D），轻轻分开叶条和真空渗透为2×5分钟。 广场上的陪替氏培养皿轨道摇床设置到第90转每分钟，在室温下和原生质体为3-4小时。 在温育的叶条应彼此分开的，通过使用一个平镊子，在半小时的时间间隔。 放置一个70μm的细胞过滤网（Fisher Scientific）的在50毫升的试管中，并轻轻的原生质体溶液通过过滤。这将删除的叶条，将保留筛，同时使原生质体去。 叶洗净条用4毫升溶液A，轻轻地通过相同的筛过滤。 将原生质体转移到圆底管和离心处理，以使在300×g离心5分钟以沉淀的原生质体的原生质体溶液。 轻轻抽吸作为不干扰的原生质体的情况下尽可能多的上清液。 洗净的原生质体，用5毫升溶液A，在300×g离心5分钟离心。除去上清液重悬的原生质体在适当体积的溶液A中 ，使用巴斯德吸管或一个截止P1000小费的。 2。 FACS的叶片原生质体</p> 排序，前立即重新悬浮使用（非切）P1000笔尖避免聚集在一起的原生质体的原生质体。 将原生质体的分类管通过50μmFILCON的过滤器（BD Biosciences公司），并适当稀释，以避免堵塞喷嘴的细胞分选仪。的原生质体进行排序使用100μm喷嘴在压力20 psi（鞘）的和21-21.5 psi（样品）的，频率为39.2千赫的事件发生率<4000（这些设置在BD流入细胞分选仪是最优（BD Biosciences公司），对其他细胞分拣机的优化可能需要调整这些设置）。 GFP阳性的原生质体用488nm的氩激光和绘图580/30的带通滤波器（橙色） – 530/40的带通滤波器（绿色）的输出来识别。 GFP阳性的原生质体将在高530/low的580人口，非GFP原生质体高580人口低530 /低580人口和死亡/死亡的原生质体和碎片相关特征研（ 图2）。 进行排序时，从该RNA将被提取的原生质体，原生质体应直接分拣到至少4倍体积的含有还原剂（ 如 β-巯基乙醇）的裂解缓冲液。此外，对单个样品的排序时间应限制在20-30分钟，并在任何一个时间内处理的和最多两至三个样本。 用于可视化排序的原生质体，将原生质体应直接排序条件到至少8体积的溶液A和其后通过离心收集集中的原生质体。 3。代表性的成果此协议描述了一种用于获得用于荧光激活细胞分选（ 图1），这是用来从拟南芥叶原生质体的方法。的存在下的原生质体产生的核糖核酸酶和转录抑制剂防止细胞fROM安装转录反应。这确实有许多死亡和垂死的原生质体，它有一个显着的自体荧光引致的后果。进行排序时，用这种方法制备的原生质体，因此，它是非常普遍地看到在580纳米 – 530 nm荧光曲线用于排序的图形的几个不同的种群。这方面的例子，连同在该协议中使用的分配门，在图3中所示。 原生质体可以排序成8倍体积的溶液A和收集用于可视化验证的富集。 图2G示出了一个这样的例子，使用的的TP382行，在保卫细胞中表达的GFP。 使用这种方法，两个前和扩增后的产率的实施例，示于表1。得到的金额是足够的Ovation微微WTA系统（500 PG-50毫微克），因此小号扩增ubsequent由任定量PCR分析（ 图4），：下一代测序或微阵列。 图1为实验的整体工作流程。 1）收获GFP的表达拟南芥叶兴趣。 2）快速切入〜1毫米宽的长条，并立即转移到原生质体的解决方案和真空渗透。 3）孵育3-4小时。 4）轻轻滤液原生质体解决方案，通过70筛，转移到圆底离心管和球团原生质体。 5）选前立即，重悬原生质体转移到排序管通过50微米的过滤器。 6）排序GFP阳性和的GFP负可行的原生质体。 7）原生质体现在可以进行分析，无论是视觉上或使用，如定量PCR技术，新一代测序或芯片。 <p class="jove_content" fo:keep-together.within页的“永远”> 图2。KC464，KC274和TP382本研究中所用的线。 A）的横截面的KC464叶的GFP表达在表皮。 B）原生质体衍生从KC464叶。 C）的横截面的KC274叶的GFP表达在血管。 D）原生质体来自KC274叶。 E）TP382叶保卫细胞中的GFP表达。 F）原生质体衍生从TP382叶。 G）例通过流式细胞仪的GFP表达的复杂背景下的叶细胞，保卫细胞中GFP含有原生质体的高530/low 580人口的从TP382叶原生质体衍生的富集。 AF：共焦显微镜图像; G：荧光显微镜图像。图像内的比例尺是50微米。 图3。典型的的FACS收购点图的输出从580/30纳米（橙色） -四十零分之五百三十nm（绿色）带通滤波器（BD涌入细胞分选仪）。的排序是那些通常用于在排序的门。 A）的点图上校-4叶衍生的原生质体，抑制剂的情况下，在原生质体，示出一个单一的低530/low 580人口。 B）的点图（重量）衍生上校-4叶原生质体，原生质体的抑制剂的存在下，示出了在580荧光移位由于压力和着色抑制剂。 CE）点图从叶派生原生质体KC74 KC464和TP382线，分别，抑制剂的存在下，在原生质体，示出了GFP包含在高530/low 580种群的种群。的事件在GFP（高530/low 580）人口的百分比。 点击这里查看大图 。 e_content的“Fo：保持together.within”页面=“总是”> 图4代表，如在图3中所示的门控人口馏分中的GFP表达。两个生物复制得到的各馏分的类型，使用GFP特异的引物（ 表2），然后进行使用的的Ovation微微WTA系统和qPCR扩增。所给出的值是最高的（红色），最低（绿色）和平均相对值。在这种情况下，高580人口一分为二，低530/low 580和高530/low的580，一个单一的生物复制使用只有单一的价值。 ACT2（At3g18780）使用所有的样品作为标准。叶：全叶。未分类的：未排序的原生质体。 GFP1：580和高530/low Rest1：低530/low 580，GFP2的：高530/high 580和Rest2：低530/high 580，如在图3和插入描述。结果是验证ØF光学评估GFP单元格内容的的排序分数（ 例如， 图2G）。 点击此处查看大图 。 样品 叶片数 细胞的数目 RNA产量 （NG） RNA产量 （放大;纳克） 全叶甲整个叶片B 1 1 – – 8001 10525 4623 *** 4572 *** 未分类的原生质体阿未分类的原生质体乙 5 5 – – 2433 2625 1152 *** 3321 *** GFP1一个 Rest1一个 15 6039（0.39％*） 55389（6.40％*） – ** – ** 861 489 GFP1乙 Rest1乙 15 10783（0.63％*） 57040（7.49％*） – ** – ** 537 420 GFP2 Rest2 15 18337（1.49％*） 62405（73.49％*） – ** – ** 360 411 表1。样品收集，使用流式细胞仪和定量PCR，以确定哪部分包含现场表达GFP的原生质体进行分析。还包括本表中的总RNA产量，吴前和扩增后，采用Ovation微微WTA系统（NuGen）的。所有的馏分GFP1，GFP2的，Rest1和Rest2如在图4中所示的插入件。 *百分比细胞的总细胞排序运行的是，给定的括号中旁边的馏分中的细胞数。这些百分比是不相关的每个样品彼此的FACS排序运行“休息”部分早于由于更大数量的休息细胞的绿色荧光蛋白组分。 * 50纳克作为输入用于扩增反应，为制造商的协议。 入门 序列 mGFP5-ER.fw GCCTGAGGGATACGTGCAGGAGA mGFP5-ER.rv TGGCGGGTCTTGAAGTTGGCT ACT2.fw GCCATCCAAGCTGTTCTCTC ACT2.rv GCCATCCAAGCTGTTCTCTC 表2中。qPCR检测。